Quan sát hình thái tế bào nấm men và đo kích thước

Khi xác định hình thái và kích thước tế bào nấm men người ta thường nuôi cấy nấm men trong môi trường thạch - mạch nha và môi trường mạch nha dịch thể. Nếu sử dụng các môi trường khác thì hình thái và kích thước tế bào nấm men có thể thay đổi, không phù hợp với hình thái và kích thước tiêu chuẩn đã được ghi trong bảng phân loại.

- Môi trường mạch nha: Lấy lúa đại mạch đã ủ cho nảy mầm (loại nhập khẩu dùng để làm bia), đem phơi khô rồi xay nhỏ thành bột. Cân 1kg bột này, thêm 3 lít nước, giữ ở 60⁰C để đường hoá cho đến khi hết tinh bột (thử với dịch Lugol không thấy có màu xanh lam). Lọc lấy dịch trong có thể thêm 3 lòng trắng trứng rồi trộn đều, đun sôi rồi lọc lấy dịch trong. Điều chỉnh bằng nước để có nồng độ đường đạt  6^o Baume.

 Phân vào các dụng cụ thuỷ tinh đã khử trùng. Nếu làm môi trường đặc thì thêm 2% thạch. Tốt nhất là dùng mầm đại mạch, nếu không thì có thể dùng mầm lúa. Nồng độ thích hợp để nuôi cấy nấm men dùng khi phân loại là 5,7^o Baume. Có tài liệu lại sử dụng nồng độ 5-8⁰ Baume. Nấm men được nuôi cấy trong các ống nghiệm thạch nghiêng hoặc các ống nghiệm đựng 3 ml môi trường dịch thể. Nuôi cấy ở 25-30⁰C trong 3 ngày, sau đó lấy ra làm tiêu bản và quan sát. Muốn đo kích thước tế bào nấm men người ta thường sử dụng trắc vi thị kính). Số tế bào nấm men được đo không ít hơn 20. Chú ý là phải đo các tế bào trưởng thành chứ không đo các chồi mới nảy sinh. Tế bào nấm men có hình thái và kích thước khác nhau tuỳ loài, tuỳ chi. Chúng có thể có hình cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình quả chanh châu Âu, hình ống v.v... Khi quan sát tế bào nấm men dưới kính hiển vi có thể phân biệt được thành tế bào, tế bào chất, không bào (vacuole) và các hạt dị nhiễm (metachromatic granules). Thành tế bào nấm men thẫm hơn so với nguyên sinh chất, còn không bào thường có hình tròn, màu nhạt hơn. Các hạt dị nhiễm thường bắt ánh sáng mạnh hơn, chúng lắc lư trong nguyên sinh chất theo chuyển động Brown. Kích thước của tế bào nấm men khác nhau rất nhiều tuỳ loài thuỳ chi, tuỳ điều kiện sinh trưởng và có thể thay đổi trong khoảng 1-5 x 5-30àm hay có khi dài hơn nữa. Kích thước tế bào của các loại nấm men thông thường vào khoảng 4-5àm.

Nhuộm màu tế bào nấm men:

Muốn quan sát tế bào nấm men một cách tỷ mỷ hơn người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm để nhuộm cả tế bào hoặc một số phần tế bào nấm men. Có thể dùng một trong những loại dung dịch thuốc nhuộm sau đây:

- Dung dịch Lugol:

Iot                                                                       2g

Iodua Kali                                                           4g

Nước cất                                                         100ml

(Nghiền nhỏ I và KI trong cối sứ rồi sau đó dùng nước hoà tan dần).

- Dung dịch xanh methylen (methylene blue)

Xanh methylen                                                        1g

Nước cất                                                        1000ml

(Có thể pha thành dung dịch 1% sau đó lọc rồi dùng nước cất pha loãng thêm 10 lần nữa).

- Dung dịch fuchsin cacbolic:

Fuchsin kiềm (basic fuchsin)                                0,1g

Cồn 90⁰                                                             10ml

Dung dịch phenol 3%                                           90ml

(Hoà tan fuchsin trong cồn, sau đó trộn đều vào dung dịch phenol).

Có thể dùng que cấy, phết dịch nuôi cấy nấm men thành một lớp mỏng trên phiến kính sau đó làm khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh methylen hay fuchsin cacbolic như khi nhuộm tiêu bản vi khuẩn. Thường người ta dùng lamelle (lá kính mỏng) để quan sát tế bào nấm men. Lấy một phiến kính sạch nhỏ lên đó một giọt thuốc nhuộm (xanh methylen chẳng hạn). Giọt thuốc nhuộm không nên to quá (về sau sẽ tràn khỏi lamelle), cũng không nên nhỏ quá (tạo thành nhiều bọt khí khi đậy lamelle). Lấy một ít nấm men đã nuôi cấy 2-3 ngày hoà vào giọt thuốc nhuộm. Đặt một cạnh của lamelle sát vào phía ngoài giọt mẫu rồi hạ từ từ lamelle xuống cho giọt mẫu tràn đều khắp lamelle. Nếu tràn ra ngoài thì dùng giấy lọc thấm bớt. Soi ở vật kính nhỏ trước, sau đó chuyển sang vật kính lớn. Có thể căn cứ vào mức độ bắt màu đậm nhạt để phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. Muốn quan sát các hạt glycogen trong tế bào nấm men thì nhuộm bằng dung dịch Lugol. Tế bào sẽ có màu vàng nhạt còn các hạt glicogen có màu đỏ nâu. Muốn quan sát các giọt mỡ trong tế bào nấm men có thể làm tiêu bản như sau:

Rỏ một giọt formalin lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít nấm men đã nuôi cấy 48-72 giờ hoà vào giọt formalin. Để yên 5 phút sau đó thêm một giọt dung dịch thuốc nhuộm xanh methylen, lại thêm một giọt thuốc nhuộm soudan III. Đặt lamelle dưới kính hiển vi rồi quan sát ta sẽ thấy nguyên sinh chất của tế bào nấm men bắt màu lam nhạt, không bào không bắt màu còn các giọt mỡ có màu đỏ hồng.

Quan sát quá trình nảy chồi của tế bào nấm men

(sử dụng cho tế bào nấm men dinh dưỡng không có dạng sợi - non filamelletous vegetative cells).

Cấy một vòng que cấy tế bào nấm men một ngày tuổi vào bình nón loại 100ml chứa 30ml môi trường dịch thể (môi trường nước chiết mạch nha, môi trường cao nấm men-pepton-glucoza hay môi trường mạch nha - cao nấm men - glucoza - pepton).

Quan sát khuẩn ty giả:

Có một số nấm men khi phát triển trong những môi trường nuôi cấy lâu hay trong những điều kiện thiếu oxy có thể tạo thành những tế bào dài, xếp nối tiếp nhau, được gọi là khuẩn ty (mycelium). Người ta phân biệt hai loại khuẩn ty: khuẩn ty giả và khuẩn ty thật. Khuẩn ty thật là các tế bào dạng sợi có vách ngăn, khuẩn ty giả là các tế bào dạng sợi không có vách ngăn. Việc tạo thành khuẩn ty là một đặc điểm quan trọng trong phân loại nấm men. Cũng có một ít loại nấm men khi phát triển bình thường cũng tạo thành khuẩn ty giả (pseudomycelium).

Muốn kiểm tra việc tạo thành khuẩn ty người ta thường nuôi cấy nấm men trên môi trường pepton - glucoza, môi trường khoai tây - glucoza hay môi trường ngô.

Quan sát bào tử bắn (Ballistoconidium, Ballistospore):

Lấy 10-15ml môi trường nước chiết mạch nha, môi trường khoai tây - glucoza hay môi trường bột ngô đưa vào một đĩa Petri khi thạch đông (nhớ làm khô vô trùng mặt thạch) lấy que cấy để cấy nấm men theo hai đường vuông góc ở giữa sau đó úp ngược lên một đĩa Petri khác chứa cùng môi trường nhưng không cấy nấm men. Trong đĩa Petri này chứa 1 lamelle vô trùng, để ở 20⁰C sau 3 tuần bào tử bắn sẽ tạo thành các khuẩn lạc trên đĩa Petri chứa môi trường ở phía dưới và lấy phần lamelle mang các bào tử bắn để đưa đi quan sát dưới kính hiển vi.

Quan sát bào tử túi (ascospore):

Một số nấm men có khả năng hình thành bào tử hữu tính gọi là bào tử túi (ascospore hay asconidium). Bào tử túi có khả năng bảo vệ nấm men chống lại với nhiều ảnh hưởng có hại của điều kiện ngoại cảnh. Thường quan sát thấy bào tử túi của nấm men trong những môi trường nuụi c?y lõu Có thể là do việc tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất đã kích thích quá trình tạo thành bào tử túi. Trong tế bào của mỗi loại nấm men sinh bào tử túi thường tạo thành một số lượng bào tử túi nhất định. Khi chứa bào tử túi thì tế bào được gọi là túi (asci, số ít - ascus).

Thường mỗi túi có 4 bào tử, một số loài chỉ có 1-2 bào tử, một số rất ít loài lại có tới 8 bào tử. Bào tử túi ở nấm men có hình dạng rất khác nhau, đây cũng là một đặc điểm thường dùng khi phân loại nấm men. Saccharomyces cerevisiae và rất nhiều loài nấm men khác có bào tử túi hình cầu hay hình trứng. Hansenula anommala, Hanseniaspora có bào tử túi hình bán cầu, phía dưới có mép như vành mũ, Pichia membranaefaciens có bào tử túi vô quy tắc (có thể có hình trứng, dài, tam giác, bầu dục, bán cầu...), Hansenula saturnus có hình bào tử túi hình quả xoài, ở giữa có một vành đai nhỏ. Bào tử túi Schawanniomyces occidentalis cũng có hình dạng tương tự như vậy nhưng bề mặt có gai. Một số loại nấm men lại có bào tử túi dài, có khi hình xoắn. Thường thường nấm men tạo thành bào tử túi sau 5-10 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch mạch nha. Muốn quan sát chỉ việc lấy một ít nấm men làm tiêu bản soi tươi không cần nhuộm màu. Mục đích việc quan sát bào tử túi phải trả lời ba câu hỏi sau đây:

1.             Nấm men có hình thành bào tử túi hay không.

2.             Bào tử túi hình thành từ các tế bào dinh dưỡng không xảy ra sự tiếp hợp trước đó hay là sau khi có sự tiếp hợp giữa hai tế bào dinh dưỡng; cũng có thể là xảy ra sau khi có sự tiếp hợp giữa tế bào mẹ và tế bào con (tế bào nảy chồi) của nó.

3.             Nghiên cứu hình dạng bào tử và số lượng của bào tử túi

Cách tiến hành:

Nấm men ‘trẻ’ sau khi nuôi cấy qua đêm được đưa vào môi trường malt - cao nấm men - glucoza - pepton và để 2-3 ngày sau đó đưa chuyển vào môi trường sinh bào tử. Giữ ở 25⁰C trong 3 ngày và quan sát dưới kính hiển vi. Nếu không quan sát thấy bào tử thì lại tiếp tục giữ và quan sát từng tuần cho đến 6 tuần liền. Các môi trường hình thành bào tử có thể được sử dụng là môi trường: V-8-agar, Gorodkowa-aga, acetat-agar, malt-yeast-glucoza, pepton-agar, malt-acetat-agar. Tuy nhiên thường sử dụng các môi trường sau:

Quan sát đặc tính nuôi cấy

Để quan sát các đặc tính nuôi cấy của nấm men người ta thường cấy nấm men lên môi trường dịch thể, môi thường thạch nghiêng và môi trường thạch đĩa (hoặc dùng chai Roux). Cấy nấm men vào các ống nghiệm đựng 3ml môi trường mạch nha 10-15⁰ Baling (xem phần “Quan sát hình thái tế bào nấm men và đo kích thước”). Nuôi cấy ở 25⁰C rồi sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 198 giờ lấy ra quan sát. Cần quan sát xem nấm men có phát triển ở bề mặt dịch thể hay không. Nếu có thì chúng tạo thành váng phủ kín, váng phủ không kín hay tạo thành một vòng quanh thành ống nghiệm. Nấm men có lắng xuống thì quan sát xem cặn có dạng xốp, dạng nhày hay dạng rắn chắc. Quan sát xem chất dịch vẫn trong hay đã trở nên đục. Dùng tay đập khẽ vào đáy ống xem cặn có nổi lên hay không (nếu cặn xốp thì dễ nổi lên, nếu cặn rắn chắc thì khó nổi lên). Dùng que cấy khều cặn, nếu cặn nhày thì dễ khều lên cả tảng, nếu không thì khó khều. Nếu có váng thì cần quan sát xem bề mặt váng như thế nào, khô hay ướt, phẳng mịn hay nhăn nheo và cũng cần quan sát xem váng dày hay mỏng. Để quan sát sự phát triển của nấm men trên môi trường thạch nghiêng ta cấy nấm men lên trường thạch - mạch nha 12-15⁰ Baling sau đó để ở tủ ấm 25-30⁰C. Quan sát ở ngày nuôi cấy thứ 3 và thứ 14. Chú ý quan sát xem bề mặt của vết cấy là trơn nhẵn hay xù xì, ướt bóng hay khô, có nếp nhăn hay không, màu sắc thế nào, mép thẳng hay mép răng cưa v.v... Để quan sát khuẩn lạc ta đem môi trường thạch - mạch nha hoặc môi trường gelatin - mạch nha phân vào các hộp Petri hay bình Roux, bình Kolle. Dùng que cấy có đầu nhọn cấy nấm men thành một chấm ở chính giữa. Trước khi cấy cần làm khô bề mặt (lớp thạch nên đổ dầy khoảng 5mm). Nuôi cấy ở 25⁰C trong 14 đến 30 ngày. Lấy ra quan sát khuẩn lạc lớn. Cần chú ý miêu tả:

- Kích thước khuẩn lạc (vẽ hình).

- Chiều dày khuẩn lạc (phải vẽ hình cắt ngang khuẩn lạc).

- Có tạo thành những vòng đồng tâm hay không?

- Có những hình tia phóng xạ hay không? (từ tâm đến giữa hay từ giữa đến mép?)

- Giữa khuẩn lạc lồi lên, lõm xuống hay phẳng?

- Bề mặt trơn, nhẵn, bóng, ướt hay xù xì, ráp, có cấu tạo nhung hay gai, có nếp nhăn hay không?

- Màu sắc khuẩn lạc.

Thí nghiệm xác định khả năng lên men các loại đường

Khả năng lên men các loại đường là một trong những chỉ tiêu quan trọng được sử dụng để phân loại nấm men. Trong thí nghiệm này người ta thường sử dụng môi trường nước chiết giá đậu hay môi trường chiết nấm men 0,5%.

- Cách làm môi trường nước chiết giá đậu: cân 200g giá đậu thêm 1000ml nước. Đun sôi 30 phút. Lọc lấy dịch trong rồi thêm nước cho đủ 1000ml.

- Cách làm môi trường nước chiết nấm men: cân 200g men bia ép (hay 100g men bia khô) thêm 1000ml nước. Hấp bằng nồi hấp áp lực trong 15 phút ở nhiệt độ 120⁰C. Lọc nóng qua nhiều lớp giấy lọc. Lại lọc nguội tới trong. Thêm nước cho đủ 1000ml. Cũng có thể dùng cao nấm men với nồng độ sử dụng là 0,5%.

Cách tiến hành:

- Sử dụng ống nghiệm có kích thước 180 x16 mm. Đặt ngược một ống Durham (50x6mm) (miệng của ống Durham chạm đáy ống nghiệm).

- Phân 10-15ml môi trường cơ sở (0,5% cao nấm men) và chứa từng nguồn đường khác nhau, ở nồng độ 50mM (tương đương 1%) riêng với rafinoza 100mM (tương đương 2%). Riêng ống kiểm tra là không có một nguồn đường nào. ống đối chứng là D-glucoza. Các ống nghiệm chứa môi trường được khử trùng sau đó cấy vào 100μl (khoảng 2 giọt) dung dịch huyền phù nấm men có mật độ 10⁷ tế bào/ml, để 25⁰C sau một tuần.

- Quan sát việc tạo CO₂ ở đáy ống Durham để biết nấm men có hay không có khả năng lên men từng nguồn đường. Có nấm men chỉ có thể phát triển ở bề mặt dịch huyền phù và chúng có khả năng đồng hoá các nguồn đường này.

- Chú ý: Theo phương pháp này một số trường hợp CO₂ tạo ra thấp phải xác định bằng điện cực CO₂ hay dùng áp kế Warburg. Trong điều kiện có quá ít lượng đường dùng làm thí nghiệm còn có thể hút môi trường chứa đường (và cấy nấm men) vào những micropipet (hút đến 1/10ml). Đầu pipet sau đó được gắn bằng vaselin (đã trộn thêm với một ít parafin). Nuôi cấy ở 25-30⁰C và hằng ngày quan sát xem có bọt khí sinh ra hay không, mức môi trường bị đẩy ra xa nhiều hay ít. Các thí nghiệm được tiến hành đầu tiên bằng glucoza. Nếu nấm men có khả năng lên men glucoza thì hãy làm tiếp thí nghiệm với các loại đường khác. Mỗi ngày quan sát kết quả lên men một lần, quan sát trong 10 ngày liền.

Thí nghiệm xác định khả năng đồng hoá các hợp chất carbon khác nhau:

Đây là đặc điểm sinh lý quan trọng dùng trong phân loại. Có 2 phương pháp chủ yếu được dùng là phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường dịch thể và môi trường đặc. Tuy nhiên còn có thể sử dụng phương pháp dùng con dấu trên môi trường đặc.

Thí nghiệm xác định khả năng đồng hoá các nguồn nitơ

Có khoảng 1/4 các chủng nấm men có khả năng sử dụng nitrat vì vậy đây là đặc điểm cần cho phân loại. Tuy nhiên các thành phần khác nhau như nitrite, ethylamine, L-lysine, sunfat amôn, cadaverine cũng cần cho các thí nghiệm phân loại. Phương pháp tiến hành thí nghiệm ở đây tương tự như các nghiên cứu với việc sử dụng các hợp chất carbon ở trên với cả môi trường dịch thể và môi trường đặc nhưng ở đây dùng môi trường carbon cơ sở (carbon base) và phải nuôi nấm men trên môi trường carbon cơ sở trong 2 ngày trước khi cấy vào các nguồn nitơ.

Do nitrit độc cho nấm men và nó dễ được hình thành trong môi trường acid do đó pH môi trường phải được điều chỉnh đến 6,5. Dùng phương pháp đánh giá sự sinh trưởng là phù hợp cho việc nghiên cứu khả năng sử dụng nitrit và ethylamin. Trong đó lượng nitrogen được dùng nên là 2-5mM (0,05-0,1%). Tuy nhiên có thể quan sát thấy sự sinh trưởng ở mức độ thấp ở các ống kiểm tra (không có nitơ) do lượng NH₃ ở khí quyển hoà tan vào môi trường.

Thí nghiệm xác định khả năng hình thành hợp chất loại tinh bột:

- Chuẩn bị dịch Lugol như sau:

5g I₂ và 10g KI được pha trong 100ml nước cất. Pha loãng 5 lần trước khi dùng.

Lodder và Kreger - van Rij đã sử dụng thí nghiệm này để phân biệt hai giống nấm men Torulopsis (không hình thành hợp chất loại tinh bột) và Cryptococcus (hình thành hợp chất loại tinh bột).

Môi trường :

(NH₄)₂SO₄:                                                         1 g

KH₂PO₄:                                                            1 g

MgSO₄.7H₂O:                                                     0,5 g

Glucoza:                                                           10 g

Thạch:                                                              25 g

Nước cất:                                                      1000 ml

pH :                                                                    4,5

Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 110⁰C (trong 15 phút) sau đó phân phối vào các hộp Petri. Trong mỗi hộp Petri đã cho sẵn một giọt hỗn dịch vitamin hoặc dịch tự phân nấm men vô trùng. Cấy nấm men và nuôi cấy 25⁰C trong 1-2 tuần. Sau đó dùng thuốc thử Lugol để kiểm tra xem có hình thành hợp chất loại tinh bột hay không. Nếu có thì vết cấy sẽ xuất hiện màu xanh.

Phương Tâm Phương (Trung Quốc) đề nghị sử dụng môi trường dịch thể sau đây:

(NH₄)₂SO₄:                                                         5 g

KH₂PO₄:                                                            1 g

MgSO₄.7H₂O:                                                     0,5 g

CaCl₂.2H₂O:                                                       0,1 g

NaCl:                                                               0,1 g

Cao nấm men:                                                    1 g

Glucoza:                                                           30 g

Nước:                                                           1000 g

Phân vào các bình tam giác một lớp môi trường cao khoảng 0,5cm rồi khử trùng. Cấy nấm men và nuôi cấy ở 25-30⁰C trong ba tuần, sau đó dùng thuốc thử Lugol để kiểm tra khả năng sinh tinh bột.

Thí nghiệm xác định nhu cầu vitamin cho sinh trưởng của nấm men:

Các nấm men khác nhau có nhu cầu khác nhau về vitamin để sinh trưởng. Các thí nghiệm ở đây nhằm kiểm tra sự sinh trưởng của chủng nấm men vắng mặt tất cả hay từng loại vitamin khác nhau.

Cách tiến hành như sau:

Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường dịch thể. Môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng trừ vitamin (môi trường không chứa nguồn vitamin nào). Toàn bộ ống nghiệm thí nghiệm được chia thành hai lô. Một lô không có mặt bất kỳ một loại vitamin nào và một lô thiếu từng vitamin lần lượt theo thứ tự dưới đây (lượng vitamin cho 1 lít môi trường).

Acid para-amino benzoic acid:                           200 mg

Biotin:                                                              20 mg

Acid folic:                                                           2 mg

Myo - inositol:                                                  10 mg

Acid nicotinic:                                                  400 mg

Pantotenat (Ca):                                                  2 mg

Pyridoxin (HCl):                                              400 mg

Riboflavin:                                                      200 mg

Tiamin HCl:                                                    400 mg

Myo - inositol cũng được dùng cho sinh trưởng hiếu khí như là nguồn carbon).

Đánh giá sự sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường cao

Một số nấm men có khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường cao so với các chủng khác.

Thí nghiệm được tiến hành như sau: ống thạch nghiêng được chuẩn bị với cao nấm men và thạch có lượng đường D-glucoza đạt 50%  (W/W). Sau đó giống nấm men được cấy vào và kiểm tra sự sinh trưởng ở 25⁰C trong 4 tuần. Chú ý tránh cho môi trường bị khô bằng cách bọc bằng giấy nến (wax-paper).

Đánh giá sự phát triển khi có mặt Cycloheximit

Thí nghiệm tiến hành trong môi trường có cao nấm men, nguồn nitơ và D-glucoza nhằm đánh giá khả năng sử dụng D-glucoza khi bổ sung xycloheximit (đã được lọc vô trùng) với nồng độ 0,1% hay 0,01%.

Xycloheximit ức chế sự sinh trưởng của Eukaryota bằng các ức chế quá trình sinh tổng hợp protein ở riboxom loại 80S. Các nấm men có khả năng chống lại được xycloheximit có thể đã có thay đổi về loại riboxom này.

Xác định hoạt tính phân giải Urea (hay hoạt tính Ureaza)

 Môi trường Christensen:

 pepton :            1g

 NaCl:                5g

 KH₂PO₄ :           2g

 glucoza :          5g

 thạch:            20g

 nước:         1000ml

Đun tan môi trường, thêm 6ml dung dịch đỏ phenol (phenol red) có nồng độ 0,2% trong cồn. Khử trùng môi trường ở nồi hấp (115⁰C/15 phút). Đợi nguội đến 50⁰C thêm 100ml dung dịch urea (dung dịch 20% khử trùng riêng qua màng lọc). Phân vào ống nghiệm thủy tinh vô trùng, làm thạch nghiêng. Sau đó cấy nấm men và giữ ở 26⁰C trong 7 ngày. Nếu nấm men có khả năng sinh ureaza để phân giải urea thì môi trường sẽ chuyển màu đỏ xẫm. Cũng có thể tiến hành thí nghiệm với môi trường dịch thể.

Thí nghiệm làm đổi màu Diazonium blue B (DBB test)

Một ống giống được cấy trên môi trường pép ton - cao men - glucoza - malt - thạch 10 ngày tuổi và giữ ở 5⁰C trong vòng vài giờ. Sau khi đổ dung dịch DBB lạnh (ice - cold) lên trên. Nếu môi trường chuyển sang màu đỏ sẫm trong 2 phút ở nhiệt độ phòng, kết quả được coi là dương tính.

Dung dịch DBB được giữ trong lạnh băng (ice - cold) và được dùng trong ít phút trước khi nó mất màu. Chuẩn bị dung dịch này bằng cách hoà tan muối DBB (Brentamine Blue B của hãng ICI Ltd., hay Hoechst AG) trong đệm Tris HCl 0,1M, trong lạnh, pH = 7,0; nồng độ 1mg/ml.

Các môi trường thí nghiệm chưa được ghi ở phần trên