Hình thái khuẩn lạc

        Lấy 15-20ml môi trường thạch vô trùng, để nguội đến 50 ⁰C rồi đổ vào đĩa Petri (thao tác vô trùng). Nếu có nước ngưng tụ trên nắp hộp cần úp ngược xuống để vào tủ ấm 30-37 ⁰C để làm khô mặt thạch.

        Lấy một vòng que cấy gạt 3-4 lần trên mặt thạch ở một góc. Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria cấy từ một vạch thành 3-4 đường khác sao cho không trùng với các đường trước. Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng hơn nữa phần vi khuẩn dính trên que cấy. Chú ý không nhấc tay lên và không thay đổi hướng của vòng que cấy.

        Đặt vào nhiệt độ thích hợp trong 1-2 ngày để chọn ra các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.

        Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không)

Hình 2.1.         Cấy ria tế bào để tách khuẩn lạc đơn và các dạng khuẩn lạc thường gặp.

Nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt

        Lấy một vòng que cấy sinh khối cấy vào các ống nghiệm có môi trường dinh dưỡng thích hợp (môi trường thạch hoặc dịch thể).

        Đặt ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau (3 ống trong một nhiệt độ). Đốivới các loài ưa ấm (mesophiles), nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt thường được kiểm tra với thang nhiệt độ 4, 20, 30, 37, 41, 45 và 65 ⁰C. Từ 37 ⁰C trở lên có thể dùng các nồi cách thủy ổn nhiệt.

        Quan sát khả năng sinh trưởng của vi khuẩn (tạo sinh khối trên môi trường thạch, hoặc đo OD nếu thí nghiệm được tiến hành trên môi trường dịch thể) 

Đặc biệt, tính bền nhiệt cần xác định khi phân loại các Liên cầu khuẩn, cách làm như sau:

·        Cấy 1 giọt dịch nuôi cấy 24 giờ vào ống nghiệm đựng môi trường dịch thể thích hợp.

·        Giữ ở nồi cách thủy 60 ⁰C trong 30 phút sau đó đặt vào tủ ấm 35-37 ⁰C, nuôi trong 48 giờ.

Nếu vi khuẩn phát triển được là có tính bền nhiệt. Dùng chủng vi khuẩn Enterococcus faecalis làm đối chứng dương tính.

Nhu cầu về O2 và CO2

Căn cứ vào nhu cầu đối với ôxy, vi khuẩn được thành các nhóm hiếu khí, kỵ khí, kỵ khí không bắt buộc và vi hiếu khí.

Nhu cầu đối với ôxy

        Vi khuẩn đã hoạt hoá cấy vào môi trường dịch thể thích hợp.

        Đặt ở các điều kiện:   - không khí chứa 5% CO₂ và 10% O₂

   - không khí bình thường.

Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn.

Tính kỵ khí của vi khuẩn sinh bào tử

        Chuẩn bị môi trường thạch kỵ khí:

Casein thủy phân                          20 g

NaCl                                             5 g

Na-mercaptoacetat                      2 g

Na-formaldehyd sulfoxylate          1 g

Thạch                                          15 g

Nước cất                                     1000 ml.

        Cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu 1 vòng que cấy (đường kính 1,5 mm) vào môi trường nói trên.

        Nuôi ở 30 ⁰C, kiểm tra kết quả sau 3 ngày và 7 ngày. Nếu vi khuẩn mọc ở phía trên là thuộc loại hiếu khí; nếu mọc dọc đường cấy là kỵ khí không bắt buộc; nếu chỉ mọc bên dưới là kỵ khí bắt buộc.

Khả năng đồng hóa các nguồn carbon

        Môi trường khoáng cơ bản (g/l):

(NH₄)₂SO₄                 2 g

MgSO₄.7H₂O             0,2 g

NaH₂PO₄.H₂O            0,5 g

CaCl₂.2H₂O               0,1 g

K₂HPO₄                     0,5 g

Nước cất                   1000 ml

        Nguồn carbon (đường, polysaccarid, rượu, axit béo, axit amin, axit hữu cơ, hydroxy axit (alcohol axit, dicarboxylic axit…) được khử trùng qua màng lọc.

        Bổ sung nguồn carbon vào môi trường khoáng cơ bản (đường và rượu ở nồng độ 0,5-1%, các loại khác ở nồng độ 0,1-0,2%), chia môi trường vào các ống nghiệm đã tiệt trùng.

        Cấy vi khuẩn vào môi trường, sử dụng 3 ống nghiệm đối với mỗi loại nguồn carbon.

        Theo dõi sự phát triển để đánh giá khả năng đồng hóa nguồn carbon.

Cách khác là chuẩn bị môi trường khoáng cơ sở có thạch và đổ đĩa Petri. Vi khuẩn được cấy dàn đều trên đĩa bằng que gạt. Nguồn carbon ở dạng tinh thể được đưa lên đĩa (khoảng bằng hạt gạo) để cho khuyếch tán dần ra xung quanh. Nếu vi khuẩn đồng hóa được nguồn carbon nào sẽ mọc thành vòng xung quanh chỗ có đặt nguồn carbon đó.

Các nguồn carbon thường được dùng trong thí nghiệm:

Đường 5C   Arabinoza, Riboza, Xyloza, Fucoza, Rhamnoza

Đường 6C   Glucoza hay Dextroza, Mannoza, Sorboza, Fructoza hay Levuloza, Galactoza

Đường kép  Saccharoza hay Sucroza-Đường kính, Maltoza, Sorboza, Lactoza, Trehaloza, Cellobioza, Melibioza

Đường tam           Raffinoza, Melizitoza

Đường đa             Tinh bột (Starch), Dextrin, Inulin, Glycogen

Rượu bậc 3           Glycerol

Rượu bậc 4           Erythritol

Rượu bậc 5           Adonitol, Arabitol, Xylitol

Rượu bậc 6           Mannitol, Sorbitol, Dulcitol

Rượu bậc 6 mạch vòng            Inozitol

Glucoside    Salicin, Coniferrin, Aesculin, Arbutyl, Amygdalin, alpha-Methylglucosid

Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ

        Môi trường cơ sở:

KH₂PO₄             1,36 g

CaCl₂                 5 ml

NaHPO_4.             2,13 g

MgSO₄.7H₂O       0,2 g

FeSO₄.7H₂O        0,5 ml

Glucoza               10 g

Nước cất              1000 ml

Glucoza có thể được thay thế bằng nguồn carbon thích hợp khác như Citrat, Acetat, Mannit… với nồng độ 0,2-0,5%. Các nguồn nitơ khác nhau (muối ammon, muối nitơrat) được đưa vào môi trường với nồng độ 0,05-0,1%. Đối chứng là môi trường hoàn toàn không bổ sung nguồn nitơ. Chỉnh pH tới 7,0-7,2.

Chia môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml/ ống), khử trùng ở 112 ⁰C trong 20-30 phút.

        Cấy vi khuẩn đã hoạt hoá 18-24 giờ (3 ống cho mỗi loại nguồn nitơ).

        Đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 3 ngày và 7 ngày. So sánh sự phát triển với đối chứng (đo độ đục của dịch tế bào) để xác định khả năng đồng hóa nguồn nitơ.

Khả năng sinh sắc tố huỳnh quang

        Môi trường làm ống thạch nghiêng:

Pepton                 20 g

Glyxerin               10 g

K₂HPO₄                1,5 g

MgSO₄.7H₂O        1,5 g

Thạch                   15 g

Nước cất              1000 ml

pH = 7,2.

Khử trùng ở 121 ⁰C trong 20 phút, đặt thạch nghiêng.

        Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa 24 giờ lên mặt thạch, đưa vào tủ ấm và theo dõi sau 1, 3, 5 ngày.

        Quan sát ống nghiệm dưới đèn tử ngoại xem có sản sinh sắc tố huỳnh quang hay không?

Tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn

        Chuẩn bị môi trường thạch đĩa thích ứng với từng loại vi khuẩn.

        Cấy gạt vi khuẩn lên mặt thạch đĩa (có thể trộn vi khuẩn vào môi trường thạch đã làm nguội tới 50 ⁰C rồi đổ đĩa).

        Đặt lên mặt thạch các khoanh giấy (tự chế hoặc mua sẵn) tẩm chất kháng khuẩn ở các nồng độ khác nhau.

        Nuôi trong tủ ấm 30 ⁰C trong 24-48 giờ.

        Quan sát các vòng vô khuẩn tạo thành xung quanh các khoanh giấy chứa chất kháng khuẩn. Vòng vô khuẩn càng lớn tức là vi khuẩn càng mẫn cảm.

Hình 2.2.         Vòng vô khuẩn tạo thành quanh các khoanh giấy thấm chất kháng khuẩn.

Đồng hóa Malonat

        Môi trường dịch thể:

Cao men                              1 g

(NH₄)₂SO₄                           2 g

K₂HPO₄                               0,6 g

KH₂PO₄                               0,4 g

Natri malonat                      3 g

Bromophenol blue (BPB)      0,025 cg

Nước cất                              1000ml

pH= 7,0-7,4

        Chia môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 121 ⁰C trong 15 phút.

Đối chứng là môi trường không có Natri-malonat.

        Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1-2 ngày.

        Quan sát sự đổi mầu của môi trường: nếu chuyển màu từ lục sang lam là có đồng hóa malonat (dương tính), nếu không là âm tính.

Hình 2.3.         Sự đổi mầu của môi trường khi vi khuẩn đồng hoá malonat.

Xét nghiệm đồng hóa Citrat

Mục đích: phân biệt các nhóm vi khuẩn đường ruột dựa trên khả năng đồng hoá citrat.

        Môi trường Simmons:

NaCl                                               5 g

MgSO₄.7H₂O                                  0,2 g

NH₄H₂PO₄                                      1 g

K₂HPO₄.3H₂O                                 1 g

Natri xitrat                                       2 g

BPB 1% trong nước                         10 ml

Thạch (đã rửa nước)                        12 g

Nước cất                                         990 ml.

Đun tan thạch, chỉnh pH đến 7,0, thêm chỉ thị màu BPB và phân vào ống nghiệm để làm thạch nghiêng. Khử trùng ở 121 ⁰C trong 15 phút.

        Cấy vi khuẩn vào ống thạch, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 3-7 ngày.

        Môi trường biến màu từ lam sang đỏ đào tức là vi khuẩn có khả năng đồng hóa citrat (dương tính).

        Với các loài Bacillus cần sử dụng môi trường sau:

NaCl                                          1 g

MgSO₄.7H₂O                             0,2 g

NH₄H₂PO₄                                 0,5 g

Natri xitrat                                 2 g

Nước cất                                   1000 ml

Đỏ phenol (Phenol red) 0,04%    20 ml.

Nhu cầu muối và tính chịu muối

        Chuẩn bị môi trường dịch thể thích hợp đối với từng loài vi khuẩn.

        Bổ sung NaCl ở các nồng độ 2, 5, 7, 10%, môi trường cần trong suốt.

        Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa, ủ trong 3-7 ngày.

        Theo dõi mức độ sinh trưởng của vi khuẩn (môi trường không cấy vi khuẩn làm đối chứng).

Khả năng đồng hóa Tartrat

        Môi trường dịch thể để kiểm tra:

Pepton                            10 g

NaCl                                5 g

Nước cất                         1000 ml

BPB (0,2%)                     12,5 ml

Kali tartrat                       10 g

Chỉnh pH = 7,4.

Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 115 ⁰C trong 20 phút, nên dùng ngay. Nếu để môi trường quá 14 ngày thì cần khử trùng lại bằng đun cách thủy 10 phút.

        Cấy vi khuẩn vào môi trường, hàng ngày theo dõi sự đổi màu.

        Sau 14 ngày thêm một lượng dung dịch chì acetat bão hòa trung tính bằng thể tích môi trường (vol/vol). Đối chứng là môi trường không cấy vi khuẩn.

        Nếu có chuyển sang màu lục vàng và có ít chì acetat kết tủa là có khả năng đồng hóa tartrat (dương tính). Nếu màu vàng hay màu lục và có nhiều chì acetat kết tủa là xét nghiệm âm tính.

        Phản ứng này dùng để phân biệt Salmonella zava (dương tính) và Salmonella paratyphi B (âm tính).

Khả năng sinh trưởng với KCN

KCN có tác dụng ức chế Escherichia coli nhưng không ức chế Citrobacter freundi, vì thế thường được dùng để phân biệt 2 loài này.

        Môi trường cơ sở:

Pepton               3 g

NaCl                  5 g

KH₂PO₄             0,22 g

K₂HPO₄             5,64 g

Nước cất           1000 ml.

pH = 7,6.

Khử trùng ở 115 ⁰C trong 20 phút. Để môi trường vào tủ lạnh cho nguội đến 4 ⁰C, thêm 15ml dung dịch KCN 0,5%, phân vào mỗi ống nghiệm 1ml (thao tác vô trùng); có thể  bảo quản được trong 2 tuần. Môi trường đối chứng không thêm dung dịch KCN.

        Cấy vi khuẩn từ mới hoạt hoá (24 giờ) vào các môi trường đã chuẩn bị trên, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 4 ngày và quan sát sự chuyển màu của môi trường.

        Nếu môi trường chuyển màu đỏ là sinh trưởng dương tính (Citrobacter freundii), nếu môi trường vẫn không màu là sinh trưởng âm tính (Escherichia coli).