GIÁO TRÌNH

Vi sinh vật học

Science and Technology

Giới thiệu tóm tắt quá trình nhân lên của một số virus điển hình

Tác giả: Nguyễn Lân Dũng

Virus DNA

4 họ đại diện là: Adenoviridae, Herpesviridae, Papovaviridae và Parvoviridae.

Adenoviridae

Họ này gồm các chi:

- Mastadenovirus, gồm 49 serotyp gây bệnh cho người như viêm phổi, viêm mũi họng, viêm kết mạc, một số gây ung thư ở chuột.

- Aviadenovirus, nhiễm ở chim, gia cầm.

- Virus chứa genome DNA kép.

- Virion dạng khối đa diện, trên mỗi đỉnh có sợi lông dài.

- Không có vỏ ngoài.

a-Cấu trúc

- Đường kính trung bình của virion 70-100nm

- Capsid chứa 7 protein:

Protein II nằm trên vỏ capsid.

Protein III hay protein penton, nằm ở đỉnh khối đa diện.

Protein IIIa nằm trên vỏ capsid.

Protein IV sợi đỉnh.

Protein VI nằm ở gần đỉnh.

Protein VIII nằm trên cạnh tam giác của khống đa diện.

Protein IX nằm gần đỉnh.

- Lõi chứa các protein.

Protein V nối DNA với protein II (penton).

Protein VII bao quanh sợi DNA.

Protein X nằm trên bề mặt tam giác của capsid.

Protein 55 kDa gắn ở đầu chuỗi gọi tắt là protein đầu chuỗi (TP).

- Ở đầu chuỗi DNA có các trình tự lặp lại đảo chiều.

b- Hấp phụ và xâm nhập

- Sợi đỉnh của virus gắn vào thụ thể (CAR) dành cho kháng thể của virus coxsackia và adeno.

- Intergrin gắn vào trình tự RGD trong protein III (penton) để giúp virus xâm nhập vào tế bào theo lối nhập bào, tạo endosome.

- Virus thoát khỏi endosome nhờ pH trong endosome thay đổi, bị vỡ ra giải phóng nucleocapsid.

- Vi ống gắn với hexon và vận chuyển virion vào gần lỗ nhân. Vỏ capsid bị phân giải, DNA được giải phóng và vào nhân qua lỗ nhân. Protein 55 kDa ở đầu 5’ bám vào màng matrix của nhân.

c- Phiên mã và dịch mã sớm

Genome được tách thành sợi R và L (phải và trái) không gọi là sợi (+) và sợi (-) vì cả 2 sợi đều có khung đọc.

Cả 2 sợi đều phiên mã tạo mRNA.
Sợi R có các gen E1A, E1B, các gen cấu trúc, gen E3.
Sợi L có các gen E2A, E2B và E4.

- RNA polymerase II phiên mã tạo mRNA của virus có mũ ở đầu 5’ và đuôi poly (A) ở đầu 3’.

mRNA E1 dịch mã tạo protein E1.
Các gen sớm trung gian E1A tham gia vào hoạt hoá trans các gen virus.

- Protein E1 gắn vào protein điều hoà của vật chủ, gắn vào hộp TATA, điều hoà ngược pha S, hoạt hoá protein p53.

Protein E1B ức chế sự chết theo lập trình (apoptosis) của tế bào.
E1 gắn pRB (protein ung thư võng mạc).

- Phiên mã sợi L để tạo mRNA cho E4 sau đó dịch mã để tạo protein E4.

E4 điều hoà ngược các gen virus, tham gia vào vận chuyển mRNA và vào tổng hợp DNA.

- Phiên mã mRNA E2, tổng hợp 3 protein quan trọng cần cho tổng hợp DNA.

- Phiên mã mRNA E3, dịch mã tạo ra protein E3 để cải biến đáp ứng miễn dịch của vật chủ ức chế apoptosis.

d-Sao chép

Sao chép DNA tiến hành khi tế bào bước vào pha S và khi E2 được tích luỹ.

- Các đoạn lặp đảo chiều ở 2 đầu dùng làm điểm khởi đầu sao chép.

- Có một protein 80 kDa (protein đầu chuỗi) và một DNA polymerase. Từ vùng E2 tạo 1 heterodimer để bắt đầu sao chép.

Cả 2 sợi của genome đều có thể bị thế chỗ do virus thực hiện sao chép theo cơ chế bán bảo thủ.
Sợi mẹ có cấu trúc cán chảo (panhandle) do có các đoạn đầu lặp đảo chiều và tiến hành phiên mã.
Protein đầu chuỗi 80 kDa bị cắt bớt để tạo thành protein 55 kDa.

e- Phiên mã và dịch mã muộn

- Sau sao chép, sự vận chuyển mRNA của vật chủ bị ức chế.

Phức hợp E4.E1B ngăn cản sự vận chuyển mRNA của vật chủ và tăng cường sự vận chuyển mRNA của virus ra khỏi nhân.
Sản phẩm của gen sớm sau hoạt hoá trans các gen muộn.

- Sự cắt nối mRNA và vị trí gắn đuôi poly (A) khác nhau tạo nên các mRNA khác nhau.

f- Lắp ráp và giải phóng

- Penton và hexon đầu tiên được lắp ráp trong tế bào chất, sau đó tập hợp trong nhân để lắp ráp thành capsid.

- DNA chui vào capsid nhờ phân tử protein đóng gói. Nếu DNA không chui được cào capsid, nó sẽ tách ra ở ngoài. Virion hoàn chỉnh ra khỏi nhân rồi toát ra ngoài.

Herpesviridae

Họ này gồm 3 chi:

Alpha herpesvirus

- HHV-1 (human herpesvirus-1) gây chốc mép.

- HHV-2, còn gọi là herpes sinh dục gây bệnh đường sinh dục.

- HHV-3 gây bệnh thuỷ đậu, zona.

- Simian herpesB gây bệnh ở khí.

Beta herpesvirus

- HHV-4 virus Epstein-Barr gây ung thư vòm họng.

- HHV-5 virus cự bào (CMV-cytomegalovirus).

- HHV-6 gây bệnh ban (ban đào).

- HHV-7 không biểu hiện triệu chứng.

- HHV-8 Sarcoma Kaposi ở người.

Gamma herpesvirus

a- Cấu trúc

- Virus có vỏ ngoài, trên bề mặt có các glycoprotein, glycoprotein bề mặt gC, gD, gB, gE, gH, gI, gK, gL, gM. Vỏ ngoài chứa lipid đường kính 150-200nm.

- Phía trong vỏ ngoài là lớp protein vô định hình (tegument) – vùng hạt chứa protein dạng cầu.

- Capsid có kích thước trung bình (100nm), dạng khối đa diện với 162 capsome.

- Lõi là DNA kép, dạng thẳng là một trong những genome lớn nhất của virus (240 kb).

b- Hấp phụ và xâm nhập

- Protein bề mặt gC của virus bám vào thụ thể bề mặt của tế bào.

+ Một số chất trung gian xâm nhập (HVEM-herpesvirus entry mediators) giúp virus gắn dặc hiệu vào glycoprotein gD.

+ Khi dung hợp với màng tế bào cần có thêm sự tham gia của các glycoprotein bề mặt khác gB, gD, gE và gI.

- Virus vào tế bào theo lối nhập bào.

- Virus tiếp cận nhân, chỉ có DNA và protein tegument mới qua lỗ nhân.

c- Phiên mã và dịch mã sớm

- Genome virus khép vòng nhưng không liên kết với protein chromatin.

- Một phần protein tegument của virus herpes simplex vẫn còn giữ lại ở tế bào chất sẽ ngăn cản sự tổng hợp protein của tế bào chủ nhờ phân huỷ polyriboxom và RNA của tế bào.

+ Protein tugument, trong đó có α-TIF (yếu tố cảm ứng trans của gen α) tiến hành hoạt hoá trans và tăng cường tổng hợp mRNA sớm ngay.

+ 5 gen α sớm ngay (khoảng 10%) không đòi hỏi tổng hợp protein mà là nguồn dự trữ cho sản phẩm gen α.

- RNA pol II phiên mã các gen α còn lại tạo mRNA để tổng hợp protein α tham gia vào sự điều hoà biểu hiện gen của virus herpes.

- Các gen β (gen sớm sau) được phiên mã ở mức độ thấp nếu không có sản phẩm của gen α.

- Gen β1 cần sản phẩm của gen α và được phiên mã trước tiên, tạo mRNA để tổng hợp ICP-6 (β16) là ribonucleotide reductase. ICP-18 (β18) là protein bám DNA.

- β2 là gen sớm sau phụ thuộc vào gen α4 và được phiên mã sau gen β1.

- Một số protein β2 ngăn cản sự tổng hợp protein α.

Các sản phẩm của gen β đạt cao nhất sau 5-7 giờ nhiễm.

d- Sao chép genome

- Trước khi tổng hợp DNA đã có một số protein cấu trúc 1.

- Virus sử dụng nhiều enzyme như helicase, primase và polymerase để tiến hành sao chép genome theo cơ chế vòng tròn xoay.

- Sao chép bắt đầu tại 3 điểm khởi đầu và nhiều đoạn RNA không được loại bỏ. Khi DNA sao chép tại nhiều điểm khởi đầu sao chép, lúc đầu được sợi đơn rất dài, sau đó tổng hợp sợi bổ sung. Đây là sợi trùng lặp (concateme) gồm nhiều genome nối với nhau. Enzyme sẽ cắt để được phân tử có kích thước và trình tự của genome.

e- Phiên mã và dịch mã muộn

- Các protein β hoạt hoá gen 1. Một số protein 1 được tạo thành trước khi tổng hợp DNA.

- Các gen  mã hoá cho các protein muộn - tức protein cấu trúc, tích luỹ trong nhân và ở màng nhân, ví dụ các capsome dạng ống, các protein bề mặt vỏ ngoài.

- Các protein  ức chế sự tổng hợp sản phẩm gen β.

Sự điều hoà biểu hiện gen của virus herpes.

Gen α được hoạt hoá bởi protein α-TIF do gen β mã hoá. Protein α tự điều hoà biểu hiện của chính mình và hoạt hoá gen β. Protein α và β hiệp đồng hoạt hoá gen , proetin  mà tham gia lắp ráp tạo virion vừa điều hoà hoạt động của gen α.

Ghi chú: → hoạt hoá; ----> ức chế

f- Lắp ráp và giải phóng

Protein tạo capsid gắn với trình tự “α” nằm trên DNA kép, cắt chúng ra khỏi sợi trùng lặp, tạo capsid, qua màng nhân. Màng nhân bọc capsid sau đó dung hợp với màng sinh chất để ra ngoài.

Papovaviridae

Gồm các chi: Papilomavirus gây bệnh mụn cóc, ung thư cổ tử cung.

Polymevirus gây viêm não.

Virus tạo bọt SV40.

a- Cấu trúc

Capsid hình khối đa: diện, đường kính 45-55nm, không có vỏ ngoài, được tạo thành từ 72 capsome. Capsome được cấu tạo từ các protein VP1, VP2 và VP3.

VP1 là protein lớn của capsid.

VP2 là protein nhỏ của capsid.

VP3 là protein capsid gắn DNA.

Lõi là DNA kép, khép vòng.

b- Hấp phụ và xâm nhập

- Virus vào tế bào biểu mô theo cơ chế nhập bào. Sự hấp phụ thay đổi tuỳ loại virus, nhưng có thể cần phân tử MHC-I, yếu tố sinh trưởng hoặc axit sialic. thụ thể của HPV-6 là integrin, của HPV-11 là heparin sulphat.

- Virus nằm trong endosome và cởi vỏ ở tế bào chất, sau đó genome DNA kép, khép vòng vào nhân qua lỗ nhân.

c- Phiên mã và dịch mã sớm

Phiên mã nhờ RNA polymerase II của tế bào để được pre-mRNA (mRNA tiền chất). Pre-mRNA cắt nối tạo 2 mRNA, nhưng có cùng mũ ở đầu 5’ và đuôi poly (A) ở đầu 3’. Có tên gọi là kháng nguyên T lớn và kháng nguyên T nhỏ.

Virus SV40 có 2 kháng nguyên T trong khi virus polyoma có 3 kháng nguyên T (thêm kháng nguyên T trung bình).

d- Sao chép genome

- Sự tích luỹ kháng nguyên T lớn có tác dụng chuyển tế bào vào pha S, bởi vì virus phụ thuộc vào bộ máy sao chép của tế bào.

- DNA của virus chuyển thành một nhiễm sắc thể nhỏ (minichromosome).

- Kháng nguyên T lớn bám vào DNA và hoạt hoạt động như enzyme helicase và ngăn chặn sự phiên mã sớm bằng cách phong bế điểm khởi đầu.

- Sự sao chép theo cơ chế theta tạo ra 2 genome giống hệt nhau.

e- Phiên mã và dịch mã muộn

- Sự chuyển vị trí khởi đầu sau sao chép DNA cho phép bắt đầu tổng hợp mRNA muộn.

- Nhờ phương thức cắt nối lựa chọn (alternative splicing) mà từ 1 bản phiên mã tạo ra được 3 mRNA có đoạn dẫn đầu không dịch mã giống nhau.

+ mRNA VP1 tổng hợp protein Vp1. Các riboxom đôi khi bắt đầu dịch mã tại điểm khởi đầu dịch mã thay đổi để tạo ra VP3.

+ mRNA Vp2/VP3 tổng hợp các protein VP2/VP3.

f- Lắp ráp và giải phóng

- VP2 và VP3 gắn vào VP1 và tín hiệu định vị nhân trên VP1 tạo thành phức hợp tích luỹ trong nhân.

- Các protein cấu trúc tự động lắp ráp với nhau tạo thành capsid rỗng. DNA loại bỏ histon-1 trước khi chui vào capsid.

- Nucleocapsid rời khỏi nhân, tạo bọng với màng lưới nội chất nhẵn để ra khỏi bề mặt đỉnh của tế bào biểu mô nhờ dung hợp với màng tế bào chất.

Parvoviridae

Gồm các chi:

- Parvovirus gây bệnh ở động vật gậm nhấm, bệnh ở chó, lợn, bệnh mắt bạch tạng cầu hạt ở mèo,...

- Erytrovirus gây bệnh ban đỏ B19.

- Dependovirus khác với 2 chi trên là các virus tự lập (autonomous) có thể tự nhân lên trong các tế bào chủ thích hợp. Dependovirus là virus khiếm khuyết, chúng chỉ có thể nhân lên khi có sự hỗ trợ của virus đồng nhiễm, ví dụ virus adeno.

Virus đi kèm adeno.

Virus đi kèm adeno ở chim.

Virus đi lèm adeno ở chó.

a- Cấu trúc

- Capsid có kích thước rất nhỏ (20nm), dạng khối đa diện, gồm 32 capsome với 60 tiểu đơn vị VP (viral protein) là VP1, VP2 (chiếm 90% tiểu đơn vị protein) và VP3.

- Lõi: DNA đơn, dạng thẳng. Hầu hết là DNA (-), ở hai đầu có đoạn palindrom (đoạn DNA mạch kép có trình tự nucleotide trên mỗi sợi giống nhau nhưng trái chiều nhau) tạo thành các nút kẹp tóc, có một đầu 3’-OH thay cho mồi.

b- Xâm nhập và cởi vỏ

- Virus B19 gắn vào thụ thể là kháng nguyên P trên bề mặt hồng cầu. Các cá thể không có thụ thể này sẽ không bị nhiễm. Cách xâm nhập và cởi vỏ còn chưa thật rõ.

- DNA đơn vận chuyển vào nhân.

c- Phiên mã và dịch mã sớm

- RNA polymerase của tế bào tổng hợp mRNA của đoạn nằm trước hộp TATA để tổng hợp protein không cấu trúc, tức là protein điều hoà.

- Cắt nối mRNA, tạo ra các bản sao RNA, gắn mũ và đuôi, được mRNA ra khỏi nhân để tổng hợp protein điều hoà NS1.

- Tương tự như vậy, tiếp tục cắt nối trong nhân để tạo mRNA dùng cho tổng hợp protein điều hoà NS2.

- Các protein không cấu trúc NS1 và NS2 vận chuyển vào nhân để tham gia sao chép DNA.

d- Sao chép genome

- Sự sao chép genome chỉ được tiến hành khi tế bào chủ ở pha S của chu kỳ tế bào.

- Đối với virus phụ thuộc adeno (AAV) đòi hỏi phải đồng nhiễm với virus adeno để kích tế bào bước vào pha S.

- Để sao chép, cần có DNA polymerase và một số enzyme của tế bào. Sao chép dựa trên mô hình kẹp tóc lăn cải biến. Sao chép bắt đầu từ đầu 3’ của nút kẹp tóc, được dùng thay cho mồi, để tổng hợp sợi DNA (+) bổ sung, kéo dài đến khi đạt chiều dài genome.

- Protein NS1 cắt và liên kết cộng hoá trị với genome, tạo ra điểm đứt trong mạch ban đầu cho phép nút kẹp tóc duỗi thẳng. Đoạn mới duỗi dùng làm khuôn để tổng hợp đoạn DNA (+) bổ sung.

- Chu kỳ tiếp tục lặp lại tạo phân tử DNA trùng lặp (concateme) rất lớn.

- Protein NS1 gắn vào mỗi trình tự genome để cắt, tạo genome hoàm chỉnh.

e- Phiên mã và dịch mã muộn

- Nhờ cắt nối lựa chọn phân tử mRNA, mà tạo được 2 phân tử mRNA cho tổng hợp 2 protein cấu trúc khác nhau là VP1 và VP2.

- VP2 lại phân cắt trong capsid nhờ enzyme để tạo VP3.

f- Lắp ráp và giải phóng

- NS1 đóng gói DNA virus ở trong nhân.

- Các protein cấu trúc (VP) vào nhân qua lỗ nhân tạo capsid.

- Cơ chế chui ra của virus còn chưa rõ.

Virus RNA

Virus có genome RNA, bao gồm RNA đơn (+), RNA đơn (-) và RNA kép, có số lượng họ rất lớn. Sau đây xin giới thiệu các họ quan trọng nhất.

Virus RNA đơn, dương

Gồm một số họ đại diện:

- Coronaviridae.

- Flaviviridae.

- Picornaviridae.

- Retroviridae.

- Togaviridae.

Coronaviridae

Có 1 chi là chi coronavirus gây bệnh:

- Viêm đường hô hấp cấp nặng (SARS).

- Coronavirus ở người (HCoV) gây bệnh đường hô hấp.

- Viêm phế quản ở chim (IBV).

- Viêm gan chuột (MHV).

- Bệnh mào xanh ở gà Tây.

a-Cấu trúc

Virus có kích thước trung bình (80-100nm)

Vỏ ngoài có các protein:

- Protein xuyên màng.

- Protein hemagglutinin esterase.

- Protein gai, hình dùi cui, gọi là teplome, nên tạo diềm quanh virus. Khi quan sát dưới kính hiển vi, diềm có hình ảnh vầng hào quang (corona tiếng Latinh la hào quang).

Nucleocapsid dạng xoắn, mềm mại. Protein nucleocapsid liên kết với genome.

Lõi Genome là RNA đơn, (+).

b- Hấp phụ và xâm nhập

- Protein gai giúp virus bám vào một loạt glycoprotein bề mặt của tế bào.

- Virus xâm nhập theo 2 cách: dụng hợp với màng sinh chất và nhập bào.

- Sự cởi vỏ và giải phóng RNA vào tế bào chất còn chưa rõ.

c- Dịch mã sớm

Genome RNA, (+) có chức năng mRNA, tiến hành dịch mã sớm tạo protein còn chưa rõ chức năng.

d- Phiên mã

- Phiên mã tạo sợi khuôn RNA (-), từ đó tổng hợp rất nhiều mRNA khác nhau.

- Phiên mã tạo sợi RNA (-) không liên tục, rồi từ đó tổng hợp rất nhiều mRNA.

e- Tổng hợp protein

- Từ các mRNA tổng hợp nhiều loại protein khác nhau, như glycoprotein gai, protein xuyên màng, protein heamagglutinin, protein cấu trúc.

f- Lắp ráp và giải phóng

- RNA genome cuộn lại, gắn với protein nucleocapsid.

- Các glycoprotein gắn vào màng bộ máy Golgi, nucleoprotein xâm nhập vào bộ máy Golgi, nối và gắn protein bề mặt của virus, lắp ráp tạo virion, sau đó ra khỏi bộ máy Golgi, tạo dung hợp với màng sinh chất để ra khỏi tế bào.

Flaviviridae

Thuộc virus Arbo nhóm B gồm các chi:

- Flavivirus gồm các virus:

+ Virus sốt Dengi/ Sốt xuất huyết Dengi.

+ Virus viêm não Nhật Bản.

+ Virus viêm não do ve.

+ Virus viêm não St. Louis.

- Pestivirus, gồm:

+ Virus gây tiêu chảy ở bò.

+ Virus gây tả lợn.

- Virus viêm gan C (HCV).

a- Cấu trúc

Hạt virus được bọc bởi vỏ ngoài đường kính 40-60 nm. Vỏ ngoài có các protein M, protein E.

- Capsid dạng khối đa diện, cấu tạo từ các protein C.

- Lõi là RNA đơn (+), đầu 5’ gắn mũ, đầu 3’ không gắn đuôi nhưng có trình tự không dịch mã.

b- Hấp phụ và xâm nhập

- Virus gắn gai vào thụ thể glycoprotein bề mặt và xâm nhập theo kiểu dung hợp hoặc nhập bào tạo endosome.

- pH thấp trong endosome làm thay đổi cấu hình trong protein E dẫn đến dung hợp với vỏ ngoài với màng endosome đẩy nucleocapsid vào tế bào chất.

- Việc cở vỏ còn chưa rõ.

c- Tổng hợp protein

Bản đồ RNA genome gồm:

5’.mũ-UTR-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’UTR-đuôi

- NS1 có trong vỏ ngoài và trong lumen

- Phức hợp protein không cấu trúc NS2b-NS3 là protease dùng để cắt các protein khác.

- NS4a và NS3 có chức năng chưa rõ.

- Peptidase tín hiệu cắt các protein còn lại.

- NS5 là RNA polymerase phụ thuộc RNA.

d- Sao chép genome

- NS3 và NS5 hoạt động cùng nhau trong phiên mã.

- Cả RF và RI đều tham gia vào phiên mã rRNA. Ở đây RF - dạng sao chép là sợi đôi trung gian được tổng hợp từ sợi đơn; RI - dạng trung gian sao chép là một số RNA được tổng hợp cùng lúc trên cùng 1 sợi khuôn genome.

- RNA virus (vRNA tức là genome) được tổng hợp nhiều gấp 10 lần c-RNA (RNA bổ sung).

- vRNA là khuôn để tổng hợp c-RNA.

- mRNA gắn mũ và đuôi, để tổng hợp protein virus.

- RNA cũng dùng làm genome.

e- Lắp ráp và giải phóng

- Tiến hành dịch mã tạo protein vỏ ngoài, gắn vào màng mạng lưới nội chất và tạo protein cấu trúc.

- RNA (có mũ và đuôi) trước hết tổng hợp sợi RNA (-) tạo sợi RNA kép dùng để phiên mã tạo RNA genome.

- Genome cuộn lại, gắn với protein C tạo capsid vào màng lưới nội chất theo kiểu nhập bào tại nơi đã gắn protein vỏ ngoài.

- Protein pr.M tạo phức với protein E để ngăn cản dung hợp với màng trong.

- Protein pr.M gắn với protein C để bắt đầu nảy chồi vào màng lưới nội chất.

- Các hạt virus được bọc trong bọng ra khỏi mạng lưới nội chất rồi dung hợp với màng tế bào để ra ngoài.

- pr.M cắt thành M để virus có thể nhiễm vào tế bào mới.

Picornaviridae

Gồm các chi:

Enterovirus:
- Polio gây bại liệt.
- Coxsackia Avà B gây viêm màng não, viêm họng rộp, bệnh Bornholm.
- Echo gây viêm màng não.
- EV71 gây bệnh tay chân miệng.
Cardiovirus (ECM) gây viêm não, cơ tim ở gặm nhấm.
Rhinovirus gây bệnh đường hô hấp trên, cảm lạnh thường.
Apthovirus gây bệnh lở mồm long móng ở động vật có móng chẽ.
Hepatovirus gây viêm gan A (HAV).
Parechovirus typ 1 và 2 gây bệnh ở người (HPEV 1 & 2).

a- Cấu trúc

Virion có kích thước nhỏ (20-30 nm).

Capsid dạng khối đa diện, không có vỏ ngoài, chứa các protein VP1, VP2, VP3 nằm trên mặt virion, VP4 nằm bên trong liên kết với RNA.

Lõi chứa genome RNA đơn, (+) cuộn chặt trong capsid. Ở virus bại liệt đầu 5’ liên kết với peptide Vpg (thay cho mũ), đầu 3’ gắn đuôi poly (A).

Phần mã hoá của genome được chia làm 3 phần P1, P2 và P3. P1 mã hoá cho protein cấu trúc VP1, VP2, VP3 và VP4. P2 mã hoá cho các protein 2^A, 2B và 2C. 2^A là protease ngăn cản dịch mã của tế bào chủ. 2B và 2C cần cho sự sao chép, trong đó 2C gắn với RNA, có hoạt tính ATP-ase và GTP-ase.

Polymerase chính của virus là C3D^pro tham gia phân cắt polyprotein nhưng có điểm cắt khác 2^A.

b- Hấp phụ và xâm nhập

- Virus gắn vào thụ thể CD155 trên bề mặt tế bào, vị trí bám là một “hẽm” (canyon) trên bề mặt capsid.

- Virus xâm nhập theo cơ chế thực bào, tạo endosome.

- Bơm proton trong endosome tạo pH khoảng 5, gây biến tính protein capsid, làm thay đổi cấu hình, lộ ra axit amin kỵ nước (không phân cực).

- Các axit amin này tương tác với lớp lipid của màng endosome, giải phóng RNA vào tế bào chất.

c- Phiên mã, sao chép và dịch mã

- Phiên mã và sao chép là cùng 1 quá trình và sử dụng enzyme như nhau.

- VPg có chức năng mồi trong sao chép.

- RNA genome có chức năng mRNA, tham gia dịch mã tạo polyprotein. Polyprotein lại được protease phân cắt thành các phân tử đơn lẻ, có chức năng khác nhau.

- Protein 3D^pol là RNA polymerase tiến hành tổng hợp sợi DNA (-). Sợi này sau đó được dùng làm khuôn để tổng hợp genome.

- Nằm trước vùng mã hoá ở đầu 5’ là cấu trúc bậc 2 IRES là “bến đỗ của riboxom” nhờ vậy mà quá trình dịch mã không cần mũ.

d- Lắp ráp và giải phóng

- Trước hết tạo protome 5S gồm VP0, VP1 và VP3.

- 5 protome tạo pentame 12-14S. 12 pentame tạp procapsid 73S, chứa 60 protome.

- RNA kết hợp với vỏ capsid tạo provirion 155S.

- Khi VP0 phân cắt thành VP2 và VP4 thì provirion sẽ trở thành virion hoàn chỉnh 155S.

- Virus được giải phóng do tan bào, đó là hệ quả của việc virus tạo enzyme ức chế các quá trình phiên mã, dịch mã của tế bào. Virus được phóng thích tiếp tục lây nhiễm vào các tế bào khác.

Retroviridae

Gồm các chi:

Avian-leukosis-sarcoma

- Virus sarcoma Rous (RSV) gây ung thư ở gia cầm.

- Virus gây bệnh nguyên hồng cầu ở chim (AEV – avian erythroblasttosis virus).

- Virus gây bệnh bạch cầu tuỷ bào (MC - myelocytomatosis).

Mammalian type-C

- Virus gây ung thư bạch cầu chuột Moloney (Mo-MLV-Moloney murine leukema).

Virus typ B

- Virus gây ung thư vú chuột (MMTV – Mouse mammary tumor virus).

Virus typ D

- Virus nhiễm ở khỉ Mason-Pfizer (MPMV – Mason – Pfizer Monkey virus).

Virus gây ung thư bạch cầu tế bào T ở người (HTLV – Human T-cell leukemia virus) hoặc ở bò (BLV – borine leukemia virus).
Lentivirus

- Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV-1, HIV-2), Visna/Msedi.

Spumavirus

- Virus tạo bọt ở người.

a- Cấu trúc

- Vỏ ngoài có nguồn gốc từ màng sinh chất với các protein:

+ Protein gai gp 120.

+ Protein gai gp 41. Hai glycoprotein này gắn với nhau nhờ liên kết S – S để tạo gp 160.

+ Protein vỏ ngoài P17 – P18.

- Capsid dạng khối trụ, chứa protein capsid P24 – P25.

- Lõi: + Genome là 2 sợi RNA đơn. (+) giống nhau.

+ Chứa protein nucleocapsid P9 - P7 gắn quanh genome.

+ Chứa enzyme phiên mã ngược (RT), integrase, Protease.

b- Hấp phụ và xâm nhập của HIV

- Protein gai gp 120 gắn vào thụ thể dặc hiệu trên bề mặt tế bào, ví dụ CD4 của tế bào T.

- Tiến hành dung hợp thông qua trung gian là vùng kị nước của protein màng TM.

- Tuỳ thuộc vào loại virus và tế bào chủ, sự dung hợp cũng xảy ra sau khi virus vào tế bào theo con đường nhập bào.

- Virus cởi vỏ và nucleocapsid vào tế bào chất.

c- Phiên mã ngược

- Phiên mã ngược xảy ra bên trong nucleoprotein trong tế bào chất

- Sơ đồ RNA (+)

Mũ-R-U5-PBS-gag-pol-env-U3-R-AAAA

- mRNA có mũ và đuôi poly A.

- 1 phân tử tRNA của tế bào đặc hiệu cho mỗi loại virus gắn vào trình tự tương bù tại vị trí gắn mồi (PBS) và tiến hành phiên mã ngược tạo cDNA.

- Enzyme RT hoạt động như một DNA polymerase phụ thuộc RNA và cũng có hoạt tính ribonuclease H.

+ Bước nhảy 1: Trình tự R của cDNA nhảy sang bắt cặp với trình tự R của RNA và tổng hợp cDNA.

+ Ribonuclease H phân huỷ toàn bộ genome RNA cũ chỉ còn để lại một mẫu ngắn (trình tự P⁺) tại vùng env để làm mồi.

+ Enzyme RT bắt đầu tổng hợp sợi DNA (+) về phía U5 để tổng hợp U3 R U5.

+ Bước nhảy 2: đoạn U3-R-U5-PBS nhảy để PBS của DNA (+) bắt cặp với PBS của DNA (-).

+ Cả 2 sợi đều được kéo dài tạo phân tử DNA kép provirus với 2 đầu là 2 đoạn lặp đảo chiều LTR (long terminal repeats) gồm U3-R-U5.

d- Gắn vào nhiễm sắc thể

- Protein nền matrix có vai trò vận chuyển DNA vào nhân.

- Provirus trong nhân khép vòng.

- Intergrase tạo điểm đứt sole trong DNA tế bào chủ tại trình tự nhận diện provirus (att).

- DNA virus được cài xen vào DNA vật chủ tạo phân tử lai.

- Các base không bắt cặp sẽ bị loại bỏ và một đoạn khuyết ngắn sẽ được lấp đầy nhờ DNA polymerase. Kết quả là loại ra 4 cặp base khỏi DNA provirus.

e- Sao chép genome và dịch mã

- Một khi được cài xen, genome virus nằm dưới sự kiểm soát của tế bào chủ và được phiên mã nhờ RNA polymerase II của tế bào.

- Đoạn U3 chứa promoter và enhancer. Phiên mã (cũng là sao chép) bắt đầu từ vị trí +1 của trình tự R tạo bản sao mRNA 35S giống với genome virus, được gắn mũ và đuôi poly (A), vừa dùng để dịch mã tạo protein dùng làm genome.

- Nhờ dịch khung (frameshift) mà tạo thành poly protein gag-pol.

- Protease của virus phân cắt polyprotein thành các protein cấu trúc và không cấu trúc riêng lẻ.

- Sự cắt nối tạo mRNA 24S, gắn mũ, đuôi để mã hoá cho protein env (protein vỏ ngoài).

- Gen gag được ưu tiên dịch mã nên protein cấu trúc vượt trội protein không cấu trúc.

Các protein tích luỹ trong tế bào chất trong đó 1 số bị cắt trong quá trình chế biến sau lắp ráp.

f- Lắp ráp và giải phóng

- Các thành phần khác nhau của virus liên kết với nhau cả trước khi polyprotein bị cắt thành các protein riêng lẻ.

- Hai sợi RNA (+) liên kết cộng hoá trị với nhau tại đầu 5’ và gắn với nucleoprotein.

- Protein capsid gắn với protein nền M và với nucleoprotein.

- Protein vỏ ngoài cài sẵn vào màng sinh chất. Nucleocapsid nảy chồi ra ngoài.

Togaviridae

Gồm các chi:

- Alphavirus có các virus viêm não ngựa Miền Tây, viêm não ngựa Miền Đông, viêm não ngựa Venezuela, virus rừng Semliki, virus Sindbis và gây nhiễm ở động vật không xương sống.

- Rubivirus: virus Rubella (sởi Đức).

- Pestivirus: virus gây tiêu chảy bò, tả lợn.

- Arterivirus: virus viêm động mạch ngựa.

a- Cấu trúc

- Virus có kích thước trung bình (50-70nm). Vỏ ngoài rất dày với các gai cấu tạo từ các protein E1, E2, E3.

+ Capsid: dạng khối đa diện cấu tạo từ các protein C. Đầu C hình thành giá đỡ cứng ở phía ngoài của capsid lõi.

+ Lõi: RNA đơn, (+) đầu 3’ và 5’ có các đoạn tương bù nên bắt cặp với nhau.

b- Hấp phụ và xâm nhập

- Gai glycoprotein gắn vào protein thụ thể bề mặt của tế bào mà bản chất còn chưa rõ. Dùng kháng thể gắn E2 thì virus không vào tế bào được.

- Virus vào tế bào theo cách nhập bào, tạo endosome.

- Endosome dung hợp với lysosom. pH thấp trong endosome làm thay đổi cấu hình protein E1 và E2 dẫn đến dung hợp màng, giúp virus thoát ra tế bào chất.

- Riboxom gắn trên protein C dẫn đến cởi vỏ.

c- Phiên mã và dịch mã sớm

- Dịch mã từ bộ 3 AUG tạo protein p1234, là do đọc mã vượt qua codon dừng.

- Enzyme cắt protein p1234 để được 4 protein:

+ NSp1 có hoạt tính polymerase cho cRNA và RNA mũ của virus.

+ NSP2 là protein dùng cắt polypeptide, có hoạt tính polymerase cRNA và tổng hợp RNA 26S dưới genome.

+ NSP3 là protein được phosphoryl hoá, chưa rõ chức năng.

+ NSP4 là RNA polymerase phụ thuộc RNA, protein 123 cắt thành 3 protein, trong đó protein thứ 2 là protease dùng để cắt polypeptide.

d- Sao chép genome

- Dịch mã tạo protein NS (không cấu trúc).

- Protein NS hình thành phức hợp với RNA polymerase để tạo RNA (-) từ sợi RNA kép trung gian, tiến hành phiên mã tạo vRNA và mRNA (gắn mũ và đuôi) để tổng hợp protein.

- Phiên mã mRNA 26S

e- Phiên mã và dịch mã muộn

- Từ v-RNA phiên mã tạo sợi RNA kép trung gian để phiên mã tạo mRNA, gắn mũ và đuôi.

- Dịch mã tạo các protein E1, P62,E2 và3), gắn vào màng mạng lưới nội chất, E1, P62, E2 và E3 kết hợp với nhau tạo gai bề mặt dạng trime.

f- Lắp ráp và giải phóng:

- Protein cấu trúc (C) gắn với vRNA để tạo provirion, xâm nhập vào mạng lưới nội chất, theo kiểu thực bào, sau đó hoàn thiện tạo virion, ra khỏi mạng lưới nội chất tạo bọng rồi ra khỏi tế bào nhờ dung hợp màng bọng với màng sinh chất.

Virus RNA đơn, âm

Ba họ đại diện là Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae và Paramyxoviridae.

Rhabdoviridae

Có 2 chi là:

(1) Vesiculovirus gây bệnh chốc mép và ở động vật không xương sống.

(2) Lyssavirus gây bệnh dại, ngoài ra virus này cũng gây bệnh ở thực vật.

a- Cấu trúc

Virus có hình viên đạn, kích thước 70x170nm.

- Vỏ ngoài là lipoprotein. Trên bề mặt có protein G, tạo gai glycoprotein. Bên trong vỏ ngoài là lớp protein nền (M).

- Nucleocapsid xoắn, gồm các protein: Protein nucleocapsid (N) gắn với genome, Photphoprotein (P), protein L.

- Lõi chứa RNA đơn, (-) với đầu lặp đảo chiều cho phép bắt cặp với nhau tạo cấu trúc cán chảo.

- RNA polymerase phụ thuộc RNA gắn vào cấu trúc lõi.

b- Hấp phụ và xâm nhập

- Virus gắn protein G vào thụ thể bề mặt, chưa rõ bản chất, của tế bào, có thể là photohatidyl serin.

- Khi gắn không cần năng lượng nhưng khi xâm nhập cần 37^oC. Nếu ở 10^oC thì không xâm nhập được.

- Virus vào theo lối nhập bào tạo endosome. Endosome dung hợp với lysosom.

- pH thấp trong endosome cảm ứng để vỏ ngoài virus dung hợp với màng endosome và giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất.

- Phiên mã và sao chép genome tiến hành trong cấu trúc nucleocapsid lõi.

c- Phiên mã mRNA

- Trong tế bào chất gRNA kháng enzyme ribonuclease khi tạo phức với protein N.

- Protein L cùng với protein P và các yếu tố của tế bào tạo phức hợp gắn vào đầu 3’ phức hợp tự phosphoryl hoá.

- Phiên mã bắt đầu từ đầu 3’ và kết thúc sau khi gắn đuôi poly (A) vào gen đầu tiên, tạo ra nhiều loại mRNA để tổng hợp protein N, P, M, G và L.

- Tổng hợp protein:

+ Từ các mRNA tương ứng tổng hợp các protein N, P, M, G, L.

+ Protein G cài vào màng mạng lưới nội chất, tạo bọng rồi mang ra gắn vào màng tế bào chất.

+ Protein M sắp xếp sát màng tế bào và gắn với protein G.

d- Sao chép genome

- Khi lượng protein N tăng lên sẽ phong bế vị trí khởi đầu phiên mã trên genome (vRNA).

- Sợi mRNA có chiều dài đủ (bằng genome) được tổng hợp nhờ phức hợp polymerase.

+ Các yếu tố của tế bào chủ có vai trò quan trọng trong sao chép genome virus.

+ Lượng protein P tăng lên là cần thiết đối với quá trình sao chép.

+ Hầu hết gRNA nhanh chóng tạo cấu trúc ribonucleoprotein. Một số gRNA dùng để phiên mã mRNA.

e- Lắp ráp và giải phóng

- Phức hợp ribonucleoprotein lỏng lẻo liên kết với protein M, ngăn cản sự sao chép và phiên mã của virus.

- Khi có nhiều protein M hơn, nó sẽ gắn vào ribonucleoprotein xoắn chặt, ngăn cản sự phiên mã và đưa chúng tới màng sinh chất để nảy chồi ra ngoài.

Orthomyxoviridae

Gồm 1 chi Orthomyxovirrus với các virus cúm A, B, C, cúm gia cầm H5N1,...

a- Cấu trúc

Virus đa hình thái, đường kính 80-120nm

- Vỏ ngoài có các protein sau:

+ Protein heamagglutinin (HA) hay gai H, gồm 2 tiểu đơn vị HA1 và HA2. Virus cúm A có 16 gai H.

+ Protein neuraminidase (NA) hay gai N. Virus cúm A có 9 loại gai N.

+ Protein kênh ion M2.

+ Protein nền M1.

- Capsid dạng xoắn gồm phức hợp ribonucleoprotein (RNP), chứa các protein: Protein nucleocapsid (NP), protein polymerase (PA), protein polymerase (PB1), protein polymerase (PB2). Genome là RNA đơn, âm, phân đoạn. Cúm A và B gồm 8 đoạn, cúm C có 7 đoạn RNA.

b- Hấp thụ và xâm nhập

- Gai H bám vào thụ thể là axit sialic trên màng tế bào, rồi xâm nhập vào tế bào theo lối nhập bào, tạo endosome rồi dung hợp với lysosom.

- pH thấp trong endosome giúp protein dung hợp (protein F) nằm ẩn phía trong gai H chồi lên, cắm vào màng endosome đẻ đẩy nucleocapsid vào tế bào chất. Enzyme từ lysosom cũng có thể phân giải màng endosome.

- Nucleocapsid vào nhân, tiến hành phiên mã và sao chép trong nhân.

c- Phiên mã

Phức hợp polymerase gồm PA, PB1 và PB2.

- RNA virus gắn vào các vị trí gắn đầu 3’ và 5’ trên PB1, RNA của tế bào gắn vào PB2.

- Virus chiếm đoạt mũ ở đầu 5’ của mRNA của tế bào để làm mồi cho mRNA của mình nhờ enzyme exonuclease, vì thế nên mới phải chui vào nhân.

- Tạo mRNA rồi ra khỏi nhân.

d- Tổng hợp protein

- Tiến hành tổng hợp các loại protein của virus ở ngoài tế bào chất sau đó chui vào nhân để tạo nucleocapsid.

e- Sao chép genome

Khi protein NP tích luỹ nhiều, chúng sẽ bám và phong bế mũ ở đầu 5’ và các gốc 4-7 A trên RNA của virus, ngăn chặn sự lặp lại của các gốc U của vRNA và tạo thành cRNA (tức sợi RNA + bổ sung).

- cDNA được protein NP bao quanh dẫn đến việc phức hợp polymerase mất đi protein PA và tiến hành sao chép vRNA từ khuôn cRNA mới tổng hợp.

- vRNA được bao bởi protein Np để tạo nucleocapsid.

f- Lắp ráp và giải phóng

- Phức hợp RNP hình thành trong nhân, cùng với protein M1 được khuếch tán thụ động vào nhân đồng thời cũng có sự gắn protein bề mặt virus vào màng sinh chất của tế bào.

- M1 gắn với RNP dẫn đến vận chuyển ra khỏi nhân.

- Protein NA cắt gốc axit sialic để giúp virus nảy chồi thoát khỏi tế bào.

Paramyxovirida

Gồm các chi:

- Paramyxovirus gồm virus Sendai (á cúm typ 1 ở chuột), á cúm typ 1và 3 ở người.

- Rubelavirus gồm virus quai bị, Newcastle, á cúm typ 2, 4ª, 4b ở người. Có protein HN.

- Morbillivirus gồm sởi, dịch sốt chó (canine distemper). Có gai H nhưng không có gai N.

- Pneumovirus, virus hợp bào hô hấp ở người (HRSV – Human respiratory syncytial virus). Không có gai H và N.

a- Cấu trúc

Virus có kích thước 125-250 nm.

- Vỏ ngoài gồm các protein:

+ Protein F (dung hợp).

+ Protein heamagglutinin – neuraminidase (HN) có hoạt tính gắn và cắt axit nucleic.

+ Protein nền (M) nằm ngay dưới vỏ ngoài .

- Nucleocapsid dạng xoắn gồm:

+ Genome là một phân tử RNA đơn, (-).

+ Protein nucleocapsid (NP) bao quanh genome, liên kết với protein M và các protein L và P.

+ Protein lớn (L) có hoạt tính polymerase.

+ Photphoprotein (P).

b- Hấp thụ và xâm nhập

- Virus gắn gai HN vào thụ thể bề mặt là axit sialic của tế bào ở pH trung tính.

- Protein F được protease của tế bào chủ cắt và cho phép dung hợp với màng tế bào để đưa nucleocapsid vào tế bào chất.

- Protein M gắn vào protein NP, ức chế tổng hợp mRNA và điều này phải được thực hiện trước khi phiên mã sớm.

c- Phiên mã mRNA

- Các gen trên gRNA tách biệt nhau nhờ trình tự gắn nằm giữa các gen gọi tắt là ICS (short intercistronic nucleotide sequences). Đây là RNA đa gen (polycistron).

- Các sản phẩm của các gen chồng lớp và tiếp đó là các sản phẩm của các gen P/C/V/D dùng trong điều hoà chu trình nhân lên.

- Phiên mã tiến hành trong cấu trúc RNP lõi, bắt đầu tại đầu 3’ và kết thúc khi thêm đuôi poly (A) vào gen đầu tiên.

- Số lượng bản sao mRNA nhiều hay ít tuỳ thuộc vào sự tái khởi động phiên mã. Phiên mã hết gen này rồi đến gen khác rồi quay lại tái khởi đầu phiên mã để được các protein NP, P, M, F, HN và L.

d- Tổng hợp protein

- Tiến hành tổng hợp protein từ mRNA trong tế bào chất.

- Protein F và Hn cài vào màng mạng lưới nội chất, hình thành bọng rồi chuyển đến gắn vào màng tế bào.

- Protein M liên kết với protein gai trong màng tế bào chất.

- Protein NP phong bế vị trí khỏi đầu và ICS cho phép bắt đầu phiên mã sợi cRNA (RNA tương bù).

e- Sao chép genome

- Từ sợi gRNA (-) làm khuôn tổng hợp sợi tương bù cRNA (+), rồi đến lượt cRNA mới sinh ra làm khuôn để tổng hợp genome RNA.

- gRNA mới sinh lại làm khuôn để tổng hợp mRNA và thêm nhiều cRNA.

- gRNA liên kết với các protein NP, P và L để tạo cấu trúc lõi.

f- Lắp ráp và giải phóng

- Protein NP gắn vào vị trí đặc hiệu bao quanh RNA tạo nucleocapsid nảy chồi ra ngoài.

- Các protein heamagglutinin – neuraminidase (HN) cắt axit sialic nằm trên bề mặt tế bào cho phép virus thoát khỏi tế bào.

Reoviridae

Bao gồm các chi:

- Orthoreovirus. Virus reo typ 1 ở người.

- Rotavirus. Virus rota gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em.

- Orbivirus. Virus gây bệnh lưỡi xanh ở gia súc, virus gây bẹnh sốt Colorado do ve

- Phytoreovirus. Virus bệnh lúa lùn, virus khối u ở thực vật.

a- Cấu trúc

Virus có đường kích trung bình (60-80nm) không có vỏ ngoài, capsid gồm 2 lớp vỏ:

- Vỏ capsid ngoài cấu tạo gồm các capsome và các tiểu đơi vị:

δ1 – protein hấp phụ.

μ1 và μ16 – protein capsid ngoài.

δ3 – protein capsid ngoài.

- Vỏ capsid trong chứa các protein:

λ1 – protein capsid trong (nằm ở bề mặt trong của capsid trong).

α2 – protein capsid trong.

μ2 – protein lõi.

α4 – protein không cấu trúc.

μ3 – protein không cấu trúc.

λ3 – RNA polymerase.

- Genome gồm 10-11 phân tử RNA kép:

L1, L2 và L3: RNA kép dài.

M1, M2 và M3: RNA kép trung bình.

S1, S2, S3 và S4: RNA kép ngắn.

b- Hấp phụ và xâm nhập

- Gai VP4 của virus bám vào thụ thể bề mặt glycophorin – A của tế bào lông ruột.

- Virus vào tế bào theo có chế nhập bào qua trung gian thụ thể, tạo endosome.

- Màng endosome dung hợp với màng lysosom. Enzyme lysosom phân giải vỏ capsid ngoài, giữ lại vỏ capsid trong và tìm cách thoát vào tế bào chất.

c- Phiên mã và sao chép

- RNA polymerase phụ thuộc RNA do virus mang theo được hoạt hoá khi vỏ ngoài bị phân huỷ bởi enzyme protease.

- RNA tiến hành phiên mã tạo mRNA trên khuôn sợi RNA (-). Quá trình thực hiện bên trong vỏ capsid.

- mRNA có 2 chức năng: mRNA và RNA khuôn để tổng hợp sợi tương bù cho genome.

- mRNA được đẩy qua kênh nằm ở đỉnh capsid vào tế bào chất.

d- Dịch mã

- mRNA tổng hợp trên riboxom các loại protein cấu trúc và không cấu trúc (enzyme).

- Protein cấu trúc lắp ráp tạo vỏ capsid trong, bao quanh 11 đoạn RNA (+). Tiếp đó sợi RNA (+) đuợc dùng làm khuôn tạo sợi RNA (-) tương bù để được genome RNA kép.

e- Lắp ráp và giải phóng

- Protein cấu trúc lắp ráp tạo vỏ capsid ngoài bao quanh capsid trong, tạo virion hoàn chỉnh, phá vỡ tế bào ra ngoài. Tế bào lông ruột bị phá huỷ, gây tiêu chảy.

Bacteriophage

Bacteriophage (Bacterriophage), viết tắt phage (phage), là virus kí sinh ở vi khuẩn. Genome của chúng có thể là DNA hoặc RNA, với kích thước nằm trong khoảng từ 2,5 đến 150kb. Phage có thể có chu trình sống đơn giản – chu trình tan hoặc phức tạp – chu trình tiềm tan, ở đó genome của chúng được cài vào NST của tế bào hoặc hoạt động theo phương thức chuyển vị.

Phage được phát hiện từ đầu thế kỷ XX, một cách độc lập, bởi hai nhà khoa học là Twort (1915) và d’Herelle (1917). Phage được nghiên cứu rất sâu rộng như là một mô hình về virus và như một công cụ để phát hiện những kiến thức cơ bản đầu tiên về DNA (DNA là vật chất di truyền, xác định mật mã di truyền, sự tồn tại của mRNA và nhiều khía cạnh sinh học phân tử cơ bản khác).

Vì phage kí sinh ở prokaryota nên chúng thường có trình tự quan trọng giống như tế bào chủ. Do vậy, chúng còn được sử dụng như là mô hình đơn giản cho nhiều khía cạnh sinh học phân tử khác nhau của prokaryota. Phage được sử dụng phổ biến như là vectơ tách dòng, liệu pháp gen, sản xuất vacxin. Nhiều enzim do phage mã hóa được dùng trong kỹ thuật di truyền để nối các đoạn gen và biểu hiện gen trong tế bào prokaryota…

Các quá trình nhân lên ở bacteriophage

Về cơ bản, các bước nhân lên của các bacteriophage trong tế bào vi khuẩn là giống nhau. Tuy nhiên, cũng có những khác biệt ở từng loại. Một số nhân lên theo chu trình tan, số khác lại nhân lên theo chu trình tiềm tan.

a. Hấp phụ: Trong môi trường dịch thể, phage ở trạng thái chuyển động tự do. Do va chạm ngẫu nhiên, phân tử protein ở đầu mút sợi lông đuôi gắn đặc hiệu vào thụ thể - phân tử polysaccharit, trên bề mặt màng ngoài của E.coli. Mỗi loại phage gắn vào một loại thụ thể, có thể là polysaccharit trên bề mặt tế bào Gram (-) hoặc axit teichoic của vi khuẩn Gram (+), số khác chỉ gắn được vào đầu mút của pili F.

b. Xâm nhập: Phage tiết lyzozim phá hủy peptidoglycan. Bao đuôi co lại, ống trục đâm xuyên qua thành tế bào, đẩy axit nucleic vào trong tế bào.

c. Tổng hợp các thành phần: Sau khi axit nucleic vào tế bào là thời kỳ ẩn (eclipse period). Không có bất kỳ một virion nguyên vẹn nào được tạo thành. Genome của virus kiểm soát bộ máy tổng hợp của tế bào, ngăn chặn sự tổng hợp bình thường của tế bào để chuyển sang tổng hợp các thành phần của phage bao gồm tổng hợp genome và protein (y như kẻ xâm lược trong một quốc gia không phòng thủ).

d.Lắp ráp: Các bộ phận đầu, đuôi, lông, v.v. được tạo thành ở các nơi khác nhau như trong phân xưởng, sau đó lắp ráp ngẫu nhiên với nhau. Genome DNA được tạo thành nhờ DNA polymerase mới tổng hợp sau đó chui vào lõi để tạo virion hoàn chỉnh.

e. Phóng thích: Lyzozim do phage tổng hợp phá hủy peptidoglycan thành tế bào. Khi thành tế bào bị phá hủy, sự thẩm thấu sẽ làm cho tế bào trương lên và vỡ ra. Phage giải phóng ra môi trường xung quanh để lặp lại chu trình nhân lên ở tế bào mới. Sau đây là một số phage có tầm quan trọng trong thực tiễn.

(1) Phage M13

Phage có dạng sợi, chứa genome DNA (+) đơn, khép vòng, với kích thước 6,4Kb. M13 gắn đặc hiệu vào pili F (pili được mã hóa bởi plasmit, gọi là yếu tố F, chỉ có ở tế bào “đực”) của E.coli thông qua protein phụ (g3p) nằm trên vỏ ở đầu sợi phage. Sự gắn này cảm ứng làm thay đổi cấu trúc của protein chính tạo nên vỏ capsid khiến toàn hạt co ngắn lại tạo động lực bơm DNA vào tế bào chất. DNA polymease của tế bào tổng hợp một sợi bổ sung tạo DNA kép dạng sao chép (RF). Genome gồm 10 gen nằm sát nhau, có một vùng xen nhỏ (intergenic region) ở đó chứa điểm khởi đầu sao chép (ori). Phiên mã xảy ra (vẫn nhờ enzyme của tế bào chủ) tại bất kỳ một trong số vài promoter, cho đến khi gặp một trong hai điểm kết thúc (terminator). Quá trình này dẫn đến những gen nằm gần điểm kết thúc được phiên mã nhiều hơn so với các gen nằm xa, và đây cũng là phương thức chủ yếu trong việc điều hòa sự biểu hiện gen của phage M13. Tất cả RF đều được tổng hợp như tổng hợp DNA kép bình thường, nhưng sự khởi đầu sao chép cần phải cắt đứt sợi (+) nhờ enzyme endonuclease (sản phẩm của gen 2) để hở đầu 3’-OH, mà không cần mồi. Từ mỗi RF liên tục tạo ra các sợi DNA (+) dành cho đóng gói tạo virion. Các sợi này không dùng được làm khuôn tạo sợi DNA (-) vì ngay sau khi được tổng hợp, chúng đã được bao bọc bởi protein, sản phẩm của gen 5. Cấu trúc này được chuyển ra màng tế bào, ở đó DNA bám vào protein chính của capsid trên màng tế bào rồi chui ra theo lối nảy chồi mà không phá vỡ tế bào.

Vi khuẩn nhiễm M13 vẫn tiếp tục sinh trưởng và phân chia, cho dù với tốc độ thấp hơn, tạo ra thế hệ tế bào mới và giải phóng M13. Lượng DNA được chui là ra khác nhau, nên các hạt có kích thước khác nhau. Trong quần thể luôn có những hạt mang nhiều genome và những hạt mang một phần genome.

Nhờ cách nhân lên kỳ lạ và cấu tạo genome đặc biệt mà M13 được sử dụng có hiệu quả trong công nghệ sinh học:

- Genome là chuỗi đơn nên được dùng trong giải trình tự.

- Dạng trung gian RF (DNA kép khép vòng) như là một plasmit nên được dùng làm vectơ tách dòng.

- Không có sự hạn chế về kích thước genome nên có thể gắn một đoạn DNA ngoại lai lớn.

- Do không làm tan tế bào, nên có thể duy trì và liên tục tách chiết một lượng lớn DNA tách dòng.

(2) Phage T7

Cũng như các phage khác, T7 cũng có đầu hình khối đa diện gắn với một đuôi ngắn với 6 sợi lông đuôi.

Phage T7 có kích thước nhỏ, có genome là DNA kép (khoảng 40 Kb) dạng thẳng.

Trước hết đầu mút sợi lông đuôi gắn vào thụ thể LPS trên màng sinh chất. Khi xâm nhập, một đầu của genome (gọi là đầu trái) bao giờ cũng đi vào trước, do vậy bản đồ genome được chia theo phần trăm tính từ đầu trái. Ngay sau khi genome vào tế bào chất, RNApolymease phụ thuộc DNA bình thường của E.coli nhận ra 3 promoter của các gen sớm ngay, nằm giữa vị trí 1% và 2%, ở đầu 3’ của genome. Tất cả các sản phẩm của các gen sớm đều tham gia vào sự điều khiển làm dừng phiên mã của tế bào chủ, chuẩn bị cho sao chép và biểu hiện genome virus.

Bản phiên mã sớm được ribonuclease III của tế bào chủ phân cắt thành các mRNA, trong đó có mRNA mã hóa cho protein kinase (gp0,7) dùng để phosphoryl hóa và làm bất hoạt RNA polymerase của vật chủ, ngăn cản sự phiên mã của các gen sớm khác. Và tổng hợp một RNA polymerase (gp1) dùng để phiên mã các gen nằm ở giữa, tham gia vào sao chép DNA T7 và các gen muộn tham gia vào lắp ráp và làm tan bào để giải phóng virus. Các sản phẩm khác, gp2, cũng gắn vào RNA polymerase của tế bào để làm bất hoạt enzyme này. RNA polymerase của T7 có tính đặc hiệu cao với promoter T7, nên ức chế RNA polymerase của tế bào và dành toàn bộ hoạt động phiên mã cho T7.

Sự sao chép genome T7 gồm 3 giai đoạn:

a.Khởi đầu diễn ra tại một vị trí nằm ở đầu trái của genome. RNA polymerase (gp1) của T7 tổng hợp một mồi ngắn từ các protomer tại vùng khởi đầu dùng cho bước khởi đầu.

b. Kéo dài từ mồi theo 2 hướng, do 2 enzyme gp5 và gp7 của T7 xúc tác. Protein gp5 gắn với thioredoxin để tạo một DNA polymerase dùng cho tổng hợp DNA từ mồi, theo hướng 5’ – 3’, do đó tạo thành sợi muộn. Protein gp4 là enzyme đa chức năng, có hoạt tính pimase, helicase và NTP-ase, nó gắn vào mạch DNA đơn duỗi xoắn của phân tử DNA mẹ và chuyển dịch theo hướng 5’ – 3’ của DNA nhờ thuỷ phân NTP. Sự mở xoắn của chuỗi DNA mẹ theo hướng chạc sao chép. Khi gặp vị trí đặc hiệu nhận biết primase, gp4 sẽ tổng hợp các mồi tetraribonucleotide (pppApCpCpC hoặc pppApCpCpA). Các mồi này cung cấp đầu 3’-OH để khởi đầu tổng hợp sợi muộn nhờ DNA polymerase của T7. Protein gp3 là một endonuclease và gp6 là một exonuclease tiến hành phân giải DNA vật chủ để cung cấp các nucleotide làm nguyên liệu cho tổng hợp DNA T7. Gp6 và DNA polymerase I của vật chủ tham gia vào loại bỏ mồi mRNA.

c.Sự tạo thành phân tử DNA trùng lặp (concatemer)

Do phân tử RNA mồi ở đầu 5’ bị loại bỏ trước khi hoàn thành sao chép, nên mỗi phân tử DNA kép mới tạo thành, có một đoạn ở đầu 5’ không được sao chép và tương ứng với nó ở đầu 3’ của mạch tương bù là đoạn đơn. Các đoạn đơn này của hai chuỗi có trình tự lặp lại cùng chiều, nên có thể gắn với nhau, tạo phân tử DNA đúp (bimolecule). Những chỗ hở được tổng hợp bổ sung và nối với nhau nhờ ligase. Concateme được endonuclease T7 (gp3) cắt tại các vị trí đặc hiệu ở cả hai phía tạo thành các đoạn đầu sole, sau đó DNA polymerase hoàn tất đầu mạch đơn (sole) thành phân tử kép đầu bằng, có kích thước của genome T7. Phage trưởng thành thoát khỏi tế bào nhờ lyzozim (gp3,5) làm tan bào. Đáng chú ý là RNA polymerase rất đặc hiệu với promoter T7, cho nên có thể tiến hành phiên mã bất kỳ trình tự DNA nào nếu có promoter T7. RNA polymerase của T7 có khả năng phiên mã mạnh gấp 5 lần RNA polymerase của E. coli, do đó thường được dùng để biểu hiện gen trong E. coli.

(3) Phage T4

T4 là một phage T chẵn, có kích thước lớn. Genome là DNA kép, dạng thẳng, chứa khoảng 100 gen với kích thước 1,7x10⁸ bp. Chu trình nhân lên bắt đầu khi lông đuôi bám vào thụ thể bề mặt của E. coli, tiết lyzozim phân giải peptidoglycan thành tế bào, rồi bơm DNA vào trong tế bào. Mặc dù genome là dạng thẳng nhưng trong quần thể, các virion chứa genome có trình tự thay đổi theo kiểu vòng tròn, tức là đổi đầu quay vòng (circular permutation) và có hai đầu lặp lại cùng chiều. Do vậy để dễ hình dung, người ta thường biểu diễn bản đồ gen của T4 là một vòng tròn. Ví dụ các virion có thể chứa các genome có trình tự sau đây:

ABCDEFGAB, CDEFGABCD, EFGABCDEF, GABCDEFGA, …

Một trong những gen được dịch mã đầu tiên là enzyme dùng để chặt nhỏ DNA của tế bào chủ, nhưng không động chạm đến DNA của phage, bởi vì base cytosin thông thường trong DNA đã được thay thế bởi một base C cải biến, 5-hydroxy metylcytosin (HMC). HMC bắt cặp với guanin nên không làm thay đổi chức năng khuôn của virus, nhưng sự có mặt của nó giúp cho enzyme virus phân biệt được axit nucleic của virus với của tế bào chủ. Sự cải biến này làm cho DNA của phage kháng lại nhiều enzyme giới hạn của tế bào chủ. Tuy nhiên, các nhóm hydroxyl của 5-HMC được cải biến bằng cách thêm gốc glucozơ, DNA đã glucosyl hoá này kháng lại hầu như tất cả các endonuclease của tế bào chủ.

Toàn bộ cho trình từ lúc bắt đầu tiếp xúc với bề mặt tế bào đến khi làm tan tế bào kéo dài 20-30 phút ở 3^oC, trong đó tổng hợp DNA bắt đầu khoảng 5 phút sau khi nhiễm.

Genome T4 gồm 3 nhóm gen sớm ngay, gen sớm sau và gen muộn.

Gen sớm ngay được phiên mã nhờ RNA polymerase (bình thường ααββ’ và δ) đã được cải biến của tế bào để tạo các protein điều hoà. Khi xâm nhập, một protein (sản phẩm của gen alt (alternation) của T4) được đưa vào tế bào chủ cùng với DNA để cải biến trình tự RNA polymerase E. coli, làm giảm ái lực của yếu tố δ với enzyme lõi (ααββ’) khiến yếu tố này không nhận diện được promoter của E. coli dẫn đến cản trở phiên mã của tế bào, nhưng lại nhận diện được promoter gen sớm của T4 để tiến hành phiên mã.
Gen sớm sau mã hoá cho enzyme DNA polymerase tham gia và sao chép và phiên mã của virus.
Gen muộn mã hoá cho các protein cấu trúc (đầu, đuôi, lông) và enzyme dùng để giải phóng phage khỏi tế bào.

Sự sao chép DNA diễn ra tương tự như ở phage T7. Phân tử mới được sao chép có đầu thừa tận cùng tại đầu 5’ của cả hai phân tử con. RNA mồi không được thay thế bởi DNA, do đó ở đầu 3’ đối diện là đoạn DNA đơn. Các base bổ sung ở đầu 3’ của 2 phân tử trùng lặp (concateme). DNA ligase hàn các chỗ đứt. Enzyme giới hạn cắt phân tử DNA concateme thành các đoạn bằng nhau tạo genome đổi đầu quay vòng.

Phiên mã genome muộn hoàn toàn phụ thuộc vào sự có mặt của DNA mới tổng hợp, là dạng có cấu trúc lỏng lẻo thuận lợi cho phiên mã. Ba peptide, sản phẩm của các gen T4 (33,45 và 55) gắn vào RNA polymerase với các chức năng là các chất hoạt hoá gen (gen activators) giúp nhận diện promoter gen muộn.

Quá trình lắp ráp và giải phóng diễn ra như ở các phage T khác. Tế bào bị phá vỡ, giải phóng 100-200 hạt phage.

DNA-ligase của T4 là enzyme xúc tác cho phản ứng tạo liên kết photphodieste giữa 3’-OH và 5’-P liền kề của phân tử DNA và RNA sợi đôi. Do enzyme này có khả năng nối các đoạn DNA có đầu sole hoặc đầu bằng, nên được sử dụng rộng rãi trong tách dòng và cải biến DNA.

(4) Phage lamda

Phage lamda là virus ôn hoà có cấu tạo giống T4, nhưng đuôi của nó chỉ có một sợi lông ngắn. Đầu chứa DNA kép, dạng thẳng. Sự lây nhiễm bắt đầu khi sợi lông đuôi gắn vào thụ thể bề mặt của E. coli, sau đó tiêm DNA vào tế bào chất. DNA của viron là sợi kép, dạng thẳng nhưng 2 đầu là mạch đơn và bổ sung cho nhau, gọi là đầu dính (cohesive end), viết tắ là cos. Ở trong tế bào chủ, hai đầu genome nhanh chóng gắn vào nhau tạo phân tử dạng vòng. Điều gì xảy ra tiếp theo là tuỳ thuộc phương thức sinh sản, chu trình tan hay chu trình tiềm tan. Chu trình tan về cơ bản giống với T4, nhưng ở đây chia làm giai đoạn.

Giai đoạn I: Từ điểm khởi đầu Ori, tiến hành sao chép theo hai hướng đối diện nhau, theo kiểu theta và kết thúc khi 2 chạc ba gặp nhau, để tạo nhiều khuôn cho phiên mã và khuôn cho sao chép.
Giai đoạn II: Từ khuôn DNA kép dạng vòng mới được tổng hợp, tiến hành sao chép theo cơ chế vòng tròn xoay (giống như ϕx174). Enzyme cắt làm đứt sợi (+) ngoài để lộ đầu 3’-OH, sợi (-) nguyên vẹn bên trong dùng làm khuôn. Sợi (-) xoay, trong khi các nucleotide gắn vào đầu 3’-OH để nối dài mạch mà không cần mồi, thường sau khi tổng hợp một đoạn DNA mạch đơn dài sẽ gắn mồi để tổng hợp mạch bổ sung, tạo phân tử DNA kép. Enzyme cắt do phage λ mã hoá sẽ cắt ở vị trí chuyên biệt trên cả hai mạch để tạo đoạn có kích thước genome. Điểm cắt là đầu dính cos.

Sau sao chép genome là phiên mã gen muộn để tạo protein cấu trúc, tiếp dó là các giai đoạn lắp ráp và giải phóng.

Điều đáng chú ý là trên DNA của λ có một đoạn (nằm giữa gen J và gen att) không đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của λ. Do đó trong kỹ thuật di truyền, phage λ được dùng làm vectơ chuyển gen. Người ta cắt bỏ đoạn này và thay vào đó đoạn gen mong muốn để tách dòng.

Chu trình tiềm tan. Ngược với chu trình tan là chu trình tiềm tan, theo đó không một thành phần nào của phage được tổng hợp và tế bào không bị tan. Genome khép vòng được cài xem vào NST của tế bào. DNA ở trạng thái này gọi là prophage. Một protein ức chế do phage mã hoá ngăn cản sự phiên mã của các gen muộn, do đó duy trì trạng thái tiềm tan. Khi tế bào phân chia, prophage cũng được phân chia theo. Trạng thái này sẽ bị mất khi chất ức chế bị bất hoạt. Ở trạng thái prophage, một vài gen của phage (ngoài gen mã hoá cho chất ức chế) vẫn có thể được biểu hiện, đôi khi làm thay đổi phenotyp của tế bào chủ, ví dụ làm thay đổi hình dạng khuẩn lạc. Các ví dụ đáng chú khác là độc tố của vi khuẩn Corynebacterium diphteriae, gây bệnh bạch cầu, được mã hoá bởi prophage. Độc tố thần kinh do Clostridium botulinum có trong các hộp thịt phồng, cũng do prophage mã hoá. Tế bào tiềm tan có thể sinh trưởng, phân chia và hình thành tế bào mới giống như tế bào mẹ. Trong thực tế, hầu hết trong nuôi cấy, vi khuẩn đều có thể mang một hoặc vài prophage, nhưng chỉ một tỷ lệ rất nhỏ 1/10000 hoặc 1/100000 prophage có thể tách khỏi nhiễm sắc thể để tiến hành chu trình tan, tạo virion mới và gải phóng ra môi trường. Các virion được giải phóng không ảnh hướng tới các tế bào tiềm tan khác, bởi vì protein ức chế luôn duy trì prophage ở trạng thái tiềm tan, giúp tế bào tiềm tan “miễn dịch” trước sự xâm nhập của virus cùng loại. Do có sự “miễn dịch” nên các phage ôn hoà chỉ tạo vệt tan khi cho xâm nhiễm vào các chủng không phải tiềm tan. Các vệt tan xuất hiện rất đặc trưng. Các virus độc tạo vệt tan rất rõ trong khi virus tiềm tan chỉ tạo vệt tan mờ. Các vệt tan nhìn thấy được vì nhiều tế bào bị tan do các phage tiến hành chu trình tan. Vệt tan mờ là vì một số tê bào tiềm tan vẫn sống sót, sinh sản trong vệt tan.

(5) Phage chuyển vị (TP)

Phage chuyển vị (transposable phage) chủ yếu gặp ở các vi khuẩn Gram âm, nhất là Pseudomonas. Một trong các ví dụ điển hình nhất là phage Mu. Phage chuyển vị có vòng đời theo cả chu trình tan và tiềm tan, giống như phage λ, nhưng klhác ở phương thức sao chép genome. Ở pha tan sớm, một số quá trình phức tạp liên quan đến enzyme transposase của virus, DNA polymerase của vi khuẩn và một số enzyme khác (của virus và vi khuẩn) tiến hành sao chép DNA và cài bản sao genome mới tạo thành của virus vào tế một vị trí nào đó trên NST của tế bào và do đó có thể làm bất hoạt các gen tại vị trí gắn dẫn đến đột biến. Không có genome nguyên ven của virus rời khỏi NST tế bào chủ. Chỉ sau một số vòng chuyển vị sao chép (replicative transposition), genome virus cùng với một phần DNA liền kề của tế bào được tách ra khỏi tế bào để thực hiện chu trình tan.

Phage chuyển vị được dùng phổ biến trong công nghệ sinh học để đưa gen mong muốn vào các tế bào nhân sơ.

TẢI VỀ

TÁI SỬ DỤNG

MỤC LỤC

Vi sinh vật học

NỘI DUNG CÙNG TÁC GIẢ