Sự đồng hoá phosphorus

Phosphorus gặp trong các acid nucleic, protein, phospholipid, ATP và các coenzyme như N ADP. N guồn phosphorus phổ biến nhất là các este của phosphate vô cơ và phosphate hữu cơ. Phosphate vô cơ được cố định qua việc tạo thành ATP

thông qua một trong ba con đường: 1) quang phosphoryl hoá; 2) phosphoryl hoá oxy hoá và 3) phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất. Đường phân cung cấp một ví dụ của con đường thứ ba. Phosphate được gắn với glyceraldehyde-3-phosphate tạo thành 1,3-bisphosphorusglycerat, sau đó chất này được dùng để tổng hợp ATP.

Glyceraldehyde-3-phosphate + Pi + N AD+ → 1,3-bisphosphorusglycerat + N ADH

+ H+ 1,3-bisphosphorusglycerat + ADP → 3-phosphorusglycerat + ATP

Vi sinh vật có thể thu nhận các phosphate hữu cơ từ môi trường bao quanh ở

dạng hoà tan hay dạng hạt. Các este của phosphate hữu cơ thường bị thuỷ phân bởi các phosphatease và tách ra phosphate vô cơ. Vi khuNn gram âm chứa các phosphatease trong khoang chu chất nằm giữa thành tế bào và màng sinh chất;vì vậy sau khi được giải phóng phosphate được hấp thu trực tiếp qua màng. Động vật nguyên sinh, trái lại, có thể sử dụng trực tiếp các phosphate hữu cơ sau khi ăn hoặc

thuỷ phân chúng trong lyzosom và tiêu thụ phosphate.

Sự đồng hoá sulfur

Sulfur cần cho việc tổng hợp amino acid (cystein và methionine) và một số coenzyme (coenzyme A, tiamine-pyrophosphate và biotin) và có thể thu được từ

hai nguồn. N hiều vi sinh vật sử dụng cystein và methionine dẫn xuất từ các nguồn bên ngoài hoặc từ dự trữ amino acid nội bào. N goài ra, sulfate có thể cung cấp

sulfur cho sinh tổng hợp. N guyên tử sulfur trong sulfate oxy hoá hơn nguyên tử sulfur trong cystein và các phân tử hữu cơ khác, do đó sulfate phải bị khử trước khi

có thể được đồng hoá. Quá trình này được gọi là sự khử sulfate đồng hoá để phân biệt với sự khử sulfate dị hoá diễn ra khi sulfate tác dụng như chất nhận electron trong hô hấp kỵ khí.Sự khử sulfate đồng hoá đòi hỏi phải hoạt hoá sulfate qua việc tạo thành phosphoadenosine-5’-phosphosulfate (Hình 18.8) tiếp theo là sự khử sulfate. Đây là một quá trình phức tạp (Hình 18.9) trong đó sulfate trước hết bị khử thành sulfit ( 2 3 SO － ) sau đó thành H2S. Cystein có thể được tổng hợp từ sulfua hydro qua hai con đường.

cs, 2005)

N ấm có thể kết hợp H2S với serine tạo thành cystein nhưng nhiều vi khuNn lại gắn H2S với O-Acetylserine (quá trình 1 và 2, lần lượt) (1) H2S + Serine →Cystein + H2O (2) Serine O-Acetylserine Cystein

Một khi được tạo thành cystein có thể được dùng để tổng hợp các hợp chất hữu cơ khác có chứa sulfur.

Sự đồng hoá nitrogen

Do là thành phần chủ yếu của các protein, acid nucleic, coenzyme và nhiều thành phần khác nên năng lực đồng hoá nitrogen của tế bào là cực kỳ quan trọng. Mặc dù khí quyển giàu khí nitrogen nhưng chỉ một số ít vi khuNn có thể khử khí này và sử dụng làm nguồn nitrogen. Còn hầu hết vi sinh vật có khả năng đồng hoá ammonia hoặc nitrate.

Sự đồng hoá ammonia

N itrogen của ammonia có thể được chuyển hoá thành chất hữu cơ tương đối dễ dàng và trực tiếp vì nitrogen ở đây gặp trong trạng thái khử hơn các dạng khác của nitrogen vô cơ. Một số vi sinh vật tổng hợp amino acid alanine trong một phản ứng amine hoá khử xúc tác bởi alanine-dehydrogenase:

Pyruvate + 4 N H + N ADH (N ADPH) + H+ alanine + N AD+(N ADP+) + H2O

glutamate.dehydrogenase (GDH) và transaminease. Các GDH phụ thuộc NADP hoặc NAD có thể tham gia vào đây. Con đường này hoạt động mạnh nhất ở những nồng độ ammonia cao ( Theo Prescott và cs, 2005)

Con đường chủ yếu đồng hoá ammonia là tạo thành glutamate từ α- ketoglutarate (một chất trung gian của chu trình TCA). N hiều vi khuNn và nấm sử dụng glutamate-dehydrogenase khi nồng độ ammonia cao:

α -ketoglutarate + 4 N H + N ADPH (N ADH) + H+ Glutamate + N ADP+ (N AD+) + H2O

Việc sử dụng N ADPH và N ADH (tác nhân khử) trong tổng hợp glutamate thay đổi tuỳ theo loài.

Một khi alanine hoặc glutamate đã được tổng hợp nhóm α-amine mới được tạo thành có thể được chuyển sang các bộ khung carbon khác thông qua các phản ứng chuyển amine, từ đó sẽ xuất hiện các amino acid khác. Các transaminease chứa coenzyme pyridoxal phosphate có chức năng chuyển nhóm amine. Vi sinh vật có một số transaminease, mỗi enzyme này xúc tác việc tạo thành một số amino acid bằng cách sử dụng cùng một amino acid làm chất cho nhóm amine. Khi glutamate-dehydrogenase hoạt động phối hợp với các transaminease ammonia có thể được chuyển thành nhiều amino acid (hình 18.10).

Các phản ứng do 2 enzyme này xúc tác tham gia vào việc đồng hóa ammonia. Một số

glutamate synthetase sử dụng NADPH là nguồn electron, số khác lại sử dụng ferredoxin khử

(Fd). (Nguồn Prescott và cs, 2005)

Con đường thứ hai dùng đồng hoá ammonia bao gồm 2 enzyme tác dụng theo thứ tự, đó là glutamine synthetase và glutamate-synthase (hình 18.11).

Ammonia được dùng để tổng hợp glutamine từ glutamate, sau đó nitrogen amit của glutamine được chuyển đến α-ketoglutarate để tạo thành một phân tử glutamate mới. Vì glutamate tác dụng như một chất cho amine trong các phản ứng của transaminease nên ammonia có thể được dùng để tổng hợp tất cả các amino acid thông thường khi có mặt các transaminease thích hợp (hình 18.12). Cả ATP và một nguồn các electron như N ADPH hay ferredoxin khử đều cần. Con đường này gặp ở E. coli, B. megaterium và nhiều vi khuNn khác. Hai enzyme tác dụng theo thứ tự hoạt động rất hiệu quả ở các nồng độ ammonia thấp khác với con đường glutamate dehydrogenase. N hư đã nói ở trên glutamine synthetase được điều hoà chặt chẽ nhờ sự cải biến cộng hoá trị thuận nghịch và các effector dị lập thể.

Con đường này hoạt động có hiệu quả ở những nồng độ ammonia thấp. (Theo: Prescott và cs,

2005)

Sự khử nitrate đồng hoá

N itrogen trong nitrate ( 3 N O－ ) ở trạng thái oxy hoá hơn nhiều so với nitrogen trong ammonia. N itrate trước hết phải bị khử thành ammonia trước khi nitrogen có thể được chuyển hoá thành một dạng hữu cơ. Sự khử này của nitrate được gọi là khử nitrate đồng hoá. Quá trình này khác với quá trình diễn ra trong hô hấp kỵ khí và khử nitrate dị hoá. Trong sự khử nitrate đồng hoá nitrate được chuyển thành chất hữu cơ và không tham gia vào việc sản sinh năng lượng. Khử nitrate đồng hoá gặp phổ biến ở vi khuNn, nấm và tảo. Quá trình nói trên diễn ra trong tế bào chất ở vi khuNn. Bước thứ nhất trong đồng hoá nitrate là khử nitrate thành nitrite xúc tác bởi nitrate reductase là enzyme chứa FAD và molipden (Hình 18.13), N ADPH là

nguồn electron:

3 N O－ + N ADPH +H+ → 2 N O－ + N ADP+ + H2O

Sau đó, nitrite bị khử thành ammonia thông qua một số lần bổ sung 2 electron được xúc tác bởi nitrite reductase và có thể cả các enzyme khác. Hydroxylamine có thể là một chất trung gian. Tiếp theo ammonia được chuyển hoá thành các amino acid nhờ các con đường đã mô tả.

Con đường này gặp ở các vi khuẩn có thể khử và đồng hóa nitrogen của nitrate. Theo: Prescott

và cs, 2005)

Sự cố định Nitrogen (Nitrogen fixation)

Sự khử khí nitrogen của khí quyển được gọi là sự cố định nitrogen. Vì nồng độ của ammonia và nitrate thường thấp, hơn nữa chỉ một số vi khuNn có khả năng trên (các tế bào nhân thật hoàn toàn không thể thực hiện được cố định N 2) nên tốc độ của quá trình này trong nhiều hoàn cảnh, hạn chế sinh trưởng của thực vật. Cố định nitrogen gặp ở: 1) các vi khuNn sống tự do (ví dụ: Azotobacter, Klebsiella, Clostridium và Methanococcus); 2) các vi khuNn cộng sinh với thực vật như các

cây họ Đậu (Rhizobium), cây phi lao (xạ khuNn Frankia) và bèo dâu (vi khuNn lam Anabaena azollae) và 3) các vi khuNn lam (Nostoc và Anabaena). Sự khử nitrogen thành ammonia được xúc tác bởi enzyme nitrogenase. Mặc dù các chất trung gian gắn vào enzyme ta còn chưa rõ nhưng có lẽ nitrogen bị khử qua một số lần bổ sung 2 electron như Hình 18.14 mô tả. Sự khử nitrogen phân tử thành ammonia phát nhiệt mạnh nhưng phản ứng có năng lượng hoạt hoá cao do nitrogen phân tử là một khí trơ với một liên kết ba giữa hai nguyên tử nitrogen. Vì vậy, sự khử nitrogen là tốn kém và tiêu thụ nhiều ATP. Ít nhất 8 electron và 16ATP, cứ 4ATP là cần cho một cặp electron.

N 2 + 8H+ + 8e + 16ATP → 2N H3 + H2 + 16ADP + 16Pi

Prescott và cs, 2005)

Các electron bắt nguồn từ ferredoxin đã bị khử bởi một số con đường, chẳng hạn qua quang hợp ở vi khuNn lam, qua các quá trình hô hấp ở các vi khuNn cố định nitrogen hiếu khí hoặc qua lên men ở các vi khuNn kỵ khí. Ví dụ, Clostridiumpasteurianum (một vi khuNn kỵ khí) khử ferredoxin trong quá trình oxy hoá Pyruvate, trong khi Azotobacter (một vi khuNn hiếu khí) lại sử dụng electron từ

N ADPH để khử ferredoxin. N itrogenase là một phức hệ gồm 2 protein chủ yếu: một protein MoFe (hay nitrogenase, MW 220.000) liên kết với 1-2 protein Fe (haynitrogenase reductase, MW 64.000). Protein MoFe chứa 2 nguyên tử molipden và 28-32 nguyên tử sắt; protein Fe chứa 4 nguyên tử sắt hình 18.15). Fe và Mo của protein MoFe được chứa bên trong một cofactor gọi là FeMo-co và sự khử N 2 diễn ra ở cofactor này. Trước hết protein Fe bị khử bởi ferredoxin sau đó nó liên kết ATP (hình18.16). Sự liên kết ATP làm thay đổi hình thể của protein Fe và hạ thấp thế khử của protein này (từ 100mV đến ∼ 400 mV) tạo điều kiện cho protein Fe khử protein MoFe. ATP bị thuỷ phân khi diễn ra sự chuyền electron này. Cuối cùng, protein MoFe hử chuyền các electron tới nitrogen nguyên tử.

Một số vi khuNn chứa enzyme hidrogenase oxi hóa H2 thành H2O và liên kết phản ứng này với việc tạo thành ATP hay với việc khử ferredoxin (Fd) hoặc flavodoxin (Fld) rồi các chất này lại có thể chuyển electron cho protein Fe. N itrogenase rất mẫn cảm với O2 và phải được bảo vệ sao cho khỏi bị bất hoạt bởi O2 bên trong tế bào. Ở nhiều vi khuẩn lam sự bảo vệ này được thực hiện nhờ một cấu trúc đặc biệt gọi là dị bào nang (heterocyst), có vách dày, chỉ chứa hệ quang I (dùng tổng hợp ATP nhưng không tạo thành O2). N itrogenase cố định N 2 bên trong dị bào nang và nhận được saccarose từ các tế bào lân cận sau đó truyền nitrogen cố định được cho các tế bào trên. Ở các vi khuNn hiếu khí, cố định N 2 như Azotobacter nitrogenase được bảo vệ nhờ: (1) Lớp vỏ nhày bao quanh tế bào cản trở sự khuếch tán của O2 vào tế bào; (2) Vận tốc hô hấp cao nhờ đó O2 bị loại bỏ nhanh; (3) N itrogenase được kết hợp với một protein đặc biệt nhờ đó không bị bất hoạt bởi O2. N ốt rễ của các cây đậu thuộc họ Leguminosae tạo thành một protein màu đỏ gọi là leghemoglobin có khả năng liên kết O2 tự do đủ cho quá trình hô hấp tạo thành ATP nhưng không kìm hãm hoạt tính của nitrogenase của vi khuNn Rhizobium.

từ ferredoxin tới nitrogen được lặp lại 3 lần để khử N 2 thành 2 phân tử ammonia. Cân bằng ở phía dưới bao gồm cả việc khử proton thành H 2 . (Theo: Prescott và cs, 2005)

Đáng chú ý, ở đây có sự cộng sinh di truyền giữa hai cơ thể: cây tổng hợp phần protein còn vi khuNn tổng hợp nhóm hem. Tổng hợp nitrogenase không những bị kìm hãm bởi O2 nhưng cũng bởi các hợp chất nitrogen vô cơ và hữu cơ. Khi thiếu nguồn năng luợng ADP được tích lũy lại và ức chế hoạt tính của enzyme. Điều này làm tăng cái giá của sự khử N 2. Theo tính toán để cố định được 1 mg N Clostridium pasteurianum phải tiêu thụ 1g C hữu cơ trong glucose khi đó vi khuNn hiếu khí Azotobacter chroococcum thậm chí cần tới 30g. Trong điều kiện đất thiếu Mo một số vi khuNn có thể tổng hợp 2 loại nitrogenase khác: chứa Va (vanadi) Fe hay chỉ chứa Fe. Các cofactor tương tự FeMo-co gặp trong cả 2 nitrogenase nói trên nghĩa là FeVa-co (trong nitrogenase vanadi) và 1 nhóm Fe-S (tương tự FeMo-co và FeVa-co) nhưng thiếu cả Mo và Va (trong nitrogenase sắt) Sự khử nitrogen thành N H3 diễn ra qua ba bước, mỗi bước cần 2 electron (hình 18.14 và 18.16). N hư vậy 6 electron sẽ được chuyển và cần tổng cộng 12ATP đối với một phân tử nitrogen bị khử. Tuy nhiên trên thực tế quá trình thường tiêu thụ ít nhất 8 electron và 16ATP vì nitrogenase cũng khử các proton thành H2. Hydro phản ứng với diamine (HN = N H) tạo thành nitrogen và hydro. Chu trình vô ích này sản ra một phần N 2 ngay trong điều kiện thuận lợi khiến cho việc cố định nitrogen trở nên tốn kém hơn. Các vi khuNn cố định nitrogen cộng sinh có thể tiêu thụ tới 20% ATP do cây chủ sản ra N itrogenase có thể khử một số phân tử chứa liên kết ba (như Acetylen, xianit và azit)

HC → CH + 2H+ + 2e → H2C = CH2

Tốc độ khử Acetylen thành etilen được dùng để đánh giá hoạt tính nitrogenase. Một khi nitrogen phân tử đã bị khử thành ammonia, ammonia có thể được chuyển thành các chất hữu cơ. Ở Rhizobium (vi khuNn cố định nitrogen cộng sinh), có lẽ ammonia khuếch tán khỏi tế bào vi khuNn và được đồng hoá bởi các tế bào của cây đậu bao quanh. Việc đồng hoá ammonia có lẽ chủ yếu là tổng hợp glutamine bởi hệ thống glutamine synthetase - glutamate synthase (Hình 18.11). Tuy nhiên, allantoin và acid allantoic (các dẫn xuất của Purine) cũng được tổng hợp và được ùng cho việc vận chuyển nitrogen tới các phân tử khác của cây.